Modulação artificial da diferenciação neuronal e função de receptores por oligonucleotídeos sintéticos atuantes aos níveis gênico e protéico

• Processo: 01/08827-4
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Jovens Pesquisadores
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2002
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2007
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Alexander Henning Ulrich
• Beneficiário: Alexander Henning Ulrich
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Município da Instituição Sede: São Paulo
• Auxílio(s) vinculado(s): 04/08748-5 - The neuronal differentiation of p19 cells - transitions and irreversibility., AR.EXT
• Bolsa(s) vinculada(s): 06/52565-8 - Determinação da atividade farmacológica da tacrina sobre receptores nicotínicos neuronais de acetilcolina e receptores purinérgicos P2X2, BP.MS; 06/52479-4 - Desenvolvimento de aptâmeros para modulação da atividade do receptor purinérgico P2X7 na diferenciação neuronal, BP.DD; 05/55823-5 - Papel do sistema calicreina-cininas na cinetica de diferenciacao para neuronio, astrocito e oligodendrocito de celulas neuronais progenitoras embrionarias de rato., BP.PD; + mais bolsas vinculadas 05/54597-1 - Avaliacao do papel dso receptores purinergicos p2x2, p2x4 e p2x7 durante a diferenciacao neuronal in vitro utilizando a superexpressao do a superexpressao dos receptores nas linhagens de celulas p19 e a su, BP.DR; 04/10606-4 - Utilizacao da tecnica de rna de interferencia (rnai) para avaliar a participacao do receptor purinergico p2x4 na diferenciacao neuronal in vitro., BP.IC; 03/05905-0 - Imobilizacao do receptor purinergico p2x2 em fase estacionaria de co luna de cromatografia por afinidade., BP.IC; 03/06681-8 - Detecção da expressão de receptores purinérgicos do subtipo P2X durante a diferenciação neuronal de células P19 utilizando técnicas de hibridização in situ, BP.IC; 02/01290-8 - Modulação artificial da diferenciação neuronal e função de receptores por oligonucleotídeos sintéticos atuantes aos níveis gênico e proteico, BP.JP; 01/14370-7 - Estudo dos receptores P2X2 e P2X4 na diferenciação neuronal, BP.DR - menos bolsas vinculadas
• Assunto(s): Eletrofisiologia Diferenciação neuronal Receptores purinérgicos Oligonucleotídeos Interferência de RNA Células-tronco de carcinoma embrionário Aptâmeros de nucleotídeos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Aptameros De Rna | Diferenciacao Neuronal | Organizacao Nuclear | Rna Interferencia
• Publicação FAPESP: https://media.fapesp.br/bv/uploads/pdfs/Investindo...pesquisadores_62_87_88.pdf

Resumo

A linhagem P19 derivada de teratocarcinoma murino será utilizada como modelo de diferenciação neuronal in vitro. Mediante tratamento com agentes químicos em protocolos bem estabelecidos, tais células expressam (com cinéticas definidas) uma variedade de marcadores moleculares de diferenciação neuronal e comportam-se como neurônios em ensaios de eletrofisiologia. Estaremos particularmente interessados em caracterizar o mecanismo de ação de receptores purinérgicos de tipo P2X e P2Y recentemente implicados no desenvolvimento neuronal e funcionamento normal do sistema nervoso. Técnicas de eletrofisiologia de cinética rápida serão utilizadas para determinarmos os passos de velocidade envolvidos na ativação dos receptores em presença de agonistas inertes ativáveis, e o uso de inibidores genéricos nos permitirá caracterizar os sítios regulatórios constituintes dos diferentes subtipos de receptor purinérgico. Tais informações nos permitirão estabelecer protocolos para seleção de aptâmeros de RNA a partir de bibliotecas combinatórias capazes de estabilizar formas ativadas e inibidas dos receptores. Além disso, o potencial da técnica de interferência de RNA (RNAi) como forma de silenciar especificamente os genes de receptores purinérgicos será testado nessa linhagem, e caso o mecanismo de degradação de mensageiros, conservado em uma série de sistemas, esteja presente nas células P19, tal estratégia será usada para produzir knock-outs funcionais dos receptores purinérgicos. Em um segundo momento, aptâmeros selecionados capazes de interferir com a atividade de receptores ao nível proteico e RNAs dupla-fita capazes de interferir ao nível gênico serão ministrados a células em cultura em diferentes tempos do processo de diferenciação neuronal. De tal forma, poderemos avaliar o papel dos receptores purinérgicos em tal processo. O caráter embrionário de células P19 garante que as mesmas possam seguir diferentes destinos fenotípicos mediante tratamento experimental adequado, podendo assim ser diferenciadas em células musculares lisas e esqueléticas, além de neurônios e células gliais. Estudos sobre o estabelecimento de programas específicos de transcrição em modelos de transição fenotípica (diferenciação, transformação, senescência) utilizando células de eucariotos superiores em cultura não são muito comuns. As células P19 constituem um modelo particularmente interessante para o estudo de controles epigenéticos associados à diferenciação celular, pois os diferentes estágios fenotípicos -i.e. células não diferenciadas, mioblastos e neurônios -podem ser comparados de forma sistemática quanto a múltiplos parâmetros. O presente projeto visa principalmente investigar alterações da organização da cromatina no núcleo celular associadas às diferentes transições fenotípicas. Para tanto, pretendemos examinar marcadores moleculares, como a acetilação de histonas e a metilação de determinados promotores gênicos; e marcadores estruturais, tais como a localização espacial de sequências intensamente transcritas, ou não, em núcleos interfásicos e os padrões espaço-temporais de replicação e transcrição nos diferentes estágios de diferenciação. (AU)

Publicações científicas

(5)

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

SILVA, ROGÉRIO L. DA; RESENDE, RODRIGO R.; ULRICH, HENNING. Alternative splicing of P2X(6) receptors in developing mouse brain and during in vitro neuronal differentiation. Experimental Physiology, v. 92, n. 1, p. 139-145, Jan. 2007. (01/08827-4)

MARTINS, ANTONIO H.; ALVES, JANAÍNA M.; TRUJILLO, CLEBER A.; SCHWINDT, TELMA T.; BARNABÉ, GABRIELA F.; MOTTA, FABIANA L. T.; GUIMARÃES, ALESSANDER O.; CASARINI, DULCE E.; MELLO, LUIZ E.; PESQUERO, JOÃO B.; et al. Kinin-B2 receptor expression and activity during differentiation of embryonic rat neurospheres. Cytometry Part A, v. 73, n. 4, p. 361-368, Apr. 2008. (01/08827-4, 06/61285-9)

MARTINS, ANTONIO HENRIQUE B.; RESENDE, RODRIGO R.; MAJUMDER, PAROMITA; FARIA, MARCELLA; CASARINI, DULCE E.; TÁRNOK, ÁTTILA; COLLI, WALTER; PESQUERO, JOÃO BOSCO; ULRICH, HENNING. Neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells modulates kinin B2 receptor gene expression and function. Journal of Biological Chemistry, v. 280, n. 20, p. 19576-19586, May 2005. (01/08827-4)

DU‚ M.; ULRICH‚ H.; ZHAO‚ X.; ARONOWSKI‚ J.; JAYARAMAN‚ V.. Water soluble RNA based antagonist of AMPA receptors. Neuropharmacology, v. 53, n. 2, p. 242-251, 2007. (01/08827-4)

ULRICH‚ H.; TRUJILLO‚ C.A.; NERY‚ A.A.; ALVES‚ J.M.; MAJUMDER‚ P.; RESENDE‚ R.R.; MARTINS‚ A.H.. DNA and RNA aptamers: from tools for basic research towards therapeutic applications. COMBINATORIAL CHEMISTRY & HIGH THROUGHPUT SCREENING, v. 9, n. 8, p. 619-632, 2006. (01/08827-4)

Patente(s) depositada(s) como resultado deste projeto de pesquisa