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Sobre as proteínas tirosina-fosfatases. Reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e simulação computacional dos mecanismos de reação enzimática

Texto completo
Autor(es):
Arantes, Guilherme Menegon
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Imprenta: São Paulo. [2004]. xix,266 f., gráficos, ilustrações, tabelas.
Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Química
Data de defesa:
Orientador: Chaimovich Guralnik, Hernan; Loos, Michel
Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
Indexada em: Banco de Dados Bibliográficos da USP-DEDALUS; Biblioteca Digital de Teses e Dissertações - USP
Localização: Universidade de São Paulo. Biblioteca do Conjunto das Químicas; CQ T/574.1925; A662s
Assunto(s):

Proteínas

Fosfoproteínas

Resumo

Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim, regulam importantes processos bioquímicos. Dois representantes desta família são as fosfatases de dupla especificidade VHR e CDC25B. A primeira etapa de reação catalisada é um ataque nucleofílico da cadeia lateral de uma cisteína sobre o fósforo do substrato, com uma possível transferência de H+ de um ácido geral para o grupo de saída, formando um intermediário tiofosforilado e desfosforilando o substrato. Dúvidas ainda persistem sobre esta etapa, envolvendo os estados de protonação do substrato e do nucleófilo enzimático, a inatividade de certos mutantes e a identificação do ácido geral nas CDC25s. Procuramos solucionar estas questões por simulações computacionais das reações catalisadas pela VHR e pela CDC25B. Inicialmente, caminhos das reações de tiólise e alcoólise de ésteres de fosfato foram determinados por cálculos de estrutura eletrônica "ab initio" e analisados como referências da reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e como modelos da atividade enzimática. Um potencial híbrido de mecânica quântica e molecular foi amplamente testado e calibrado, empregando os caminhos de reação e outros dados "ab initio". Esta calibração permitiu que resultados semi-quantitativos pudessem ser obtidos. Potenciais de força média foram determinados com o potencial híbrido e por dinâmica molecular para desfosforilação de diferentes substratos catalisada pelas PTPs selvagens e por suas mutantes. Os resultados mostram que o mecanismo da reação catalisada segue uma adição e eliminação simultânea, com um estado de transição dissociativo, com caráter de metafosfato e as barreiras calculadas são bastante próximas às energias de ativação experimentais. O substrato enzimático é um diânion, desprotonado, e o nucleófilo está ionizado. As reações do substrato ou do nucleófilo protonados apresentam barreiras, no mínimo, 15 kcal/mol mais altas que os valores experimentais. A VHR mutante cisteína - serina no sítio ativo é inativa, porque a serina está protonada. As CDC25s não utilizam um ácido geral para catálise, ao contrário das outras PTPs. Propostas de que o ácido geral poderia ser o próprio substrato ou um dos ácidos glutâmicos presentes no sítio ativo são energeticamente inaviáveis. (AU)

Processo FAPESP: 99/04072-7 - Mecanismos da tiólise de ésteres de fosfato: modelos da fosfatase ácida SH-dependente
Beneficiário:Guilherme Menegon Arantes
Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Doutorado