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Resumo

As luciferases são as enzimas responsáveis pela bioluminescência. Essas enzimas catalisam a oxidação altamente exergônica de substratos conhecidos como luciferinas, nas quais a energia é liberada na forma de luz com alta eficiência. As luciferases de vaga-lumes são as mais conhecidas e empregadas na área biotecnológica como reagentes bioindicadores de ATP, biossensores, biomarcadores celulares, genes repórter, entre outras aplicações. Na área Biomédica, os genes de luciferases de vaga-lumes têm sido utilizados para estudos de progressão e regressão viral e bacteriana e na regressão tumoral em modelos animais. As luciferases oriundas de vaga-lumes norte-americano, europeu e japonês têm sido as mais utilizadas nessas propostas, entretanto, possuem aplicabilidade limitada, pois produzem bioluminescência de cor verde-amarelada, que é parcialmente absorvida pela hemoglobina e por tecidos ósseos. A luciferase de Phrixothrix hirtus, clonada e caracterizada por nosso grupo, é a única que produz naturalmente luz vermelha, e possui alta afinidade para luciferina e ATP, sendo potencialmente útil para ensaios analíticos e amostras pigmentadas. Porém esta enzima tem rendimento quântico e constante catalítica baixos quando comparada com as luciferases emissoras de luz verde. Baseado em conhecimentos prévios de estrutura e função desta e outras luciferases, visamos neste projeto desenvolver uma luciferase emissora de luz vermelha com maior eficiência catalítica, diminuindo o KM para os substratos e aumentando a constante catalítica e, possivelmente, melhorar o rendimento quântico, através de técnicas de mutagênese sítio-dirigida e randômica. Os resultados serão correlacionados com a estrutura da enzima. Planejamos também investigar a aplicabilidade desta enzima como reagente bioanalítico em amostras pigmentadas. (AU)

Resumo

A bioluminescência, em coleópteros, é encontrada principalmente na superfamília Elateroidea. Apesar da bioquímica do sistema bioluminescente e a morfologia das lanternas de lampirídeos serem bem estudadas, a origem e evolução das lanternas em diferentes famílias não é bem compreendida. Além disto, a origem biossintética da luciferina, um composto benzotiazólico o qual é substrato para a reação de bioluminescência, permanece pouco conhecida. Foi demonstrado que o corpo gorduroso de larvas de Aspisoma lineatum (Lampyridae) produz baixo nível de bioluminescência, sugerindo que o tecido fotogênico se originou a partir do corpo gorduroso, e que as lanternas originaram-se posteriormente por pressão de seleção para a especialização de um órgão emissor de luz. Dessa maneira, este trabalho visa o estudo comparativo dos transcriptomas das lanternas e do corpo gorduroso de larvas e adultos de A. lineatum e de outros Elateroidea bioluminescentes, possibilitando observar o que diferencia os tecidos fotogênicos dos não fotogênicos em termos de fisiologia molecular. Tais resultados auxiliariam na melhor compreensão da origem ontogênica e evolução molecular das lanternas nas diferentes famílias de besouros bioluminescentes, e na identificação de potenciais alvos envolvidos com a biossíntese da luciferina e com o controle da bioluminescência. (AU)

Resumo

As luciferases de vaga-lumes e outros besouros catalisam a oxidação de uma luciferina benzotiazólica ativada por ATP produzindo a bioluminescência. As luciferases de besouros podem ser divididas funcionalmente em pH-sensitivas ou pH-insensitivas. A sensibilidade ao pH é encontrada apenas em vaga-lumes e pode estar associada com interações de resíduos protonáveis envolvidos no fechamento e estabilização do sítio-ativo mantendo uma conformação apropriada para a emissão de luz verde. Anteriormente identificamos uma importante rede de interações polares que ajudam a manter o sito-ativo das luciferases fechado e que, possivelmente, estaria envolvida com a sensibilidade ao pH. Buscando compreender quais desses resíduos estão relacionadas com a sensibilidade ao pH, estamos realizando mutagênese sítio-dirigida com a luciferase de Macrolampis sp2, para identificar os resíduos envolvidos com a sensibilidade ao pH. Assim sendo, a candidata planeja expressar e caracterizar as luciferases selvagens e seus mutantes no laboratório para atender projetos na linha do auxílio à pesquisa 2011/23961-0 sobre sensibilidade ao pH. (AU)

Resumo

A oxidação enzimática da luciferina de vaga-lume produz uma tiazolinona sujeita a tautomerização. As propriedades fotofísicas desta tiazolinona, incluindo a cor da emissão de fluorescência, são diferentes daquelas do seu tautômero 4-hidroxitiazólico, i.e., a forma ceto fluoresce no verde, enquanto a forma enólica emite no vermelho. O objetivo deste projeto de iniciação científica é investigar o efeito do meio sobre as propriedades fotofísicas de uma biblioteca composta por dezessete 4-hidroxitiazóis. O estudo destes análogos sintéticos de pigmentos naturais permitirá verificar a ocorrência de solvatocromismo, bem como relacionar este processo com a estrutura dos compostos. Os resultados poderão levar à identificação de novas sondas fluorescentes derivadas de pigmentos naturais para aplicação em sistemas biológicos. (AU)

Resumo

A bioluminescência nos coleópteros ocorre, principalmente, dentro das famílias Elateriade, Lampyridae e Phengodidae (Elateroidea). A origem da bioluminescência dentro da superfamília Elateroidea ainda é um mistério, devido à convergência entre as famílias luminescentes e não luminescentes principalmente dentro da família Elateridae. A filogenia dessas famílias também não é clara ainda; diferentes marcadores moleculares apresentam divergências drásticas entres seus resultados. Análises das sequências de aminoácidos das luciferases indicam maior proximidade entre as famílias Lampyridae e Phengodidae, entretanto dados moleculares mostram que Elateridae é a família mais filogeneticamente relacionada à Phengodidae. Portanto, com intuito de melhor compreender a filogenia de Elateroidea Neotropical e a origem da bioluminescência nessas famílias, nós pretendemos sequenciar o genoma mitocondrial completo de algumas espécies típicas do Brasil pertencentes a família Elateridae e Phengodidae. (AU)

Resumo

Atualmente, graças aos métodos de sequenciamento de nova geração, o genoma e o transcriptoma de centenas de espécies estão disponíveis em bancos de dados e o número de sequencias geradas por esta nova tecnologia aumenta a cada dia. Entretanto, a interpretação destas informações não segue o mesmo passo. Ou seja, a elucidação da função dos genes continua sendo um desafio. Apesar da predição da função protéica de uma nova sequencia ser baseada na comparação com sequências de proteínas previamente caracterizadas e armazenadas em bancos de dados biológicos, a função específica de milhares de proteínas continua desconhecida. Um exemplo disso é a grande quantidade de enzimas tipo-luciferase de vaga-lumes anotadas para diversos organismos. As luciferases de besouros são enzimas que fazem parte da super-família das AMP/CoA ligases, enzimas que catalisam a ativação por adenilação e tioesterificação com CoA de uma ampla variedade de substratos carboxílicos. Recentemente clonamos dos túbulos de Malpighi de larvas de Zophobas (Tenebrionidae) a primeira enzima tipo-luciferase luminescente. Apesar de esta enzima ter sido clonada de um coleóptero não-luminescente e apresentar uma baixa identidade com as luciferases verdadeiras, ela apresentou uma fraca luminescência na presença de D-luciferina e MgATP, os substratos da reação bioluminescente dos besouros, com um pico em ~613 nm. Assim, esta enzima se tornou um bom modelo para estudo da origem e evolução estrutural luciferases, um dos temas mais intrigantes a respeito da bioluminescência. Apesar da caracterização cinética da luminescência desta enzima tipo-luciferase ter sido realizada, o substrato natural e sua função nos túbulos de Malpighi ainda continuam desconhecidos. Assim, o presente projeto tem como objetivo a identificação do substrato natural desta enzima, sua localização celular e a resolução de sua estrutura tridimensional. Os resultados obtidos por estes objetivos ajudarão na identificação da função desta enzima tipo-luciferase nos túbulos de Malpighi de besouros, ajudando também a determinar a função de outras enzimas tipo-luciferase. (AU)

Resumo

O Brasil é o país com a maior diversidade de espécies luminescentes de coleópteros, concentrando ca de 25% das espécies descritas e provavelmente um número ainda maior não descrito. Além de constituirem espécies importantes sob o ponto de vista científico e biotecnológico, por fornecerem enzimas e substratos bioluminescentes com valor bioanalítico, esta variedade de espécies tem um grande potencial de utilização como indicadores ambientais de impacto ambiental, especialmente de poluição luminosa em centros urbanos e como bioindicadores para a recuperação de áreas palustres degradadas, como vem sendo feito há alguns anos em prefeituras do Japão. Anteriormente investigamos a fauna de coleopteros bioluminescentes da Mata Atlântica do estado de São Paulo. Os estudos revelaram mais de 50 espécies diferentes das famílias Lampyridae, Elateridae e Phengodidae, e que a fauna da Mata Atlântica da Serra do Mar é diferenciada em relação a do Planalto Paulista. Além disto, foi feito um estudo comparativo da diversidade próxima a áreas urbanas e preservadas, mostrando que a maioria das espécies é afetada negativamente e apontando algumas espécies como potenciais indicadores noturnos de impacto ambiental, especialmente ao efeito da poluição luminosa. Entretanto, existem outras biomas que permanecem pouco estudados ou totalmente desconhecidos, entre os quais a Amazônia, que provavelmente constitui o Bioma mais rico e menos estudado, não existindo ainda estudos especificamente com a fauna de coleópteros bioluminescentes. As áreas de transição entre o cerrado e floresta Amazonica na bacia do Rio Araguaia próximas a Ilha do Bananal nos estados de Tocantins, Mato Grosso e sul do Pará constituem áreas especialmente ricas em biodiversidade, mas severamente ameaçadas pelo avanço da agricultura (especialmente soja) e pecuária. Assim neste projeto, além de continuar a investigar coleópteros bioluminescentes da Mata Atlântica, pretendemos iniciar a levantar a fauna de coleópteros bioluminescentes nesta região de transição de cerrado para floresta Amazônica, estudar sua bioluminescência sob os aspectos evolutivos molecular, investigar a potencialidade do uso destas espécies como bioindicadores de impacto ambiental. Além do desenvolvimento do projeto científico em sí, planejamos ajudar a nuclear novos grupos de pesquisas em bioluminescência na região. (AU)

Resumo

Muitas luciferases de coleópteros luminescentes já foram clonadas e sequenciadas, sendo a maioria de espécies da família Lampyridae. Apesar da clonagem de diversas luciferases, ainda não foram clonadas e comparadas as luciferases nas diferentes fases de vida (ovo, larva e adulto) de uma mesma espécie. Este tipo de estudo é particularmente relevante para melhor compreender a ontogenia e evolução molecular das luciferases e da própria bioluminescência em coleópteros. Para esta finalidade, espécies de besouros que apresentam diferentes cores de bioluminescência nas diferentes fases de vida são particularmente interessantes. O vagalume Pyrearinus termitilluminans apresenta larva com a bioluminescência mais azulada entre os besouros conhecidos, e o adulto possui lanternas abdominais e torácicas, que produzem luz amarela e verde, respectivamente. A luciferase da fase larval já foi clonada e estudos de estrutura e função já existem. Por meio de técnicas de Biologia Molecular, pretende-se clonar e sequenciar luciferases das lanternas da região dorsal do protorax e da região ventral desta espécie. O objetivo desse projeto é comparar as luciferases das diferentes fases de vida e diferentes lanternas bem como investigar os seguintes aspectos: 1) a relação estrutura e cores de bioluminescência em luciferases de elaterídeos; 2) a ontogenia e evolução molecular das luciferases de elaterídeos. (AU)

Resumo

As luciferases de vagalumes são as enzimas que produzem a bioluminescência em organismos como vagalumes. Estão sendo amplamente utilizadas para finalidades bioanalíticas nas áreas médica (Diagnósticos, e estudos pré-clínicos de patologias como infecções bacterianas, virais e câncer), biotecnológica (biossensores luminescentes) e ambiental (biossensores de toxicidade). Todas estas aplicações utilizam umas poucas luciferases oriundas dos vagalumes Norte-americano, europeu e japoneses que produzem luz verde-amarela e são sensitivas ao pH. Nosso grupo de pesquisa clonou ao longo dos ultimos anos várias luciferases de besouros brasileiros, dentre as quais luciferases únicas que produzem luz vermelha de Phrixotrix hirtus e verde-azulada de Pyrearinus termitilluminans, e luciferases pH-sensitivas de Macrolampis e Cratomorphus distinctus. Através de mutagênese sítio-dirigida, modelagem, e estudos funcionais, demonstramos que o loop entre os resíduos 223-235 desempenha um papel essencial na determinação dos espectros de bioluminescência. A interação deste loop com os resíduos E311 e R337 são aparentemente responsáveis pela manutenção de uma conformação apropriada do sítio-ativos das luciferases, responsável pela emissão de luz verde-amarela. Estudos físico-químicos indicam que o sítio ativo das luciferases verde é mais hidrofóbico que aquele da luciferase vermelha. Entretanto, ainda não conseguimos determinar que resíduos estão especificamente envolvidos com as mudanças dos espectros de bioluminescência e com a sensibilidade ao pH. Através de estudos de mutagênese sítio-dirigigida, modelagem, caracterização físico-química destas luciferases, pretendemos identificar os resíduos importantes para as cores de bioluminescência nas luciferases de Phrixotrix e Pyrearinus, e sensibilidade ao pH nas luciferases de Macrolampis e Cratomorphus. Além disto, através de mutagênese sítio-dirigida e randômica, pretendemos estabilizar estas luciferases quanto a temperatura e cinética, para torná-las mais apropriadas par fins biotecnológicos, especificamente para uso como reagente bioanalíticos e como genes repórter para células de mamíferos. Também estaremos tentando determinar as estruturas tridimensionais em colaboração com o Prof. João Barbosa (LNLS, Campinas). (AU)

Resumo

Recentemente demonstramos que o corpo gorduroso de larvas de vagalumes lampirídeos produz baixo nível de bioluminescência, expressando luciferina e luciferase, demonstrando uma conexão entre as lanternas e este tecido. A origem e evolução da bioluminescência em Elateroidea ainda permanece obscura e não está claro se este processo se originou apenas uma vez em um ancestral comum a todos os Elateroidea, sendo perdido subsequentemente em vários grupos, ou se surgiu independentemente várias vezes em diferentes grupos a partir de ancestrais com potencial para bioluminescência. Uma análise comparativa da origem bioquímica, celular e histológica da bioluminescência nas lanternas e no corpo gorduroso em larvas das três famílias poderá ajudar a melhor compreender a origem anatômica e metabólica da bioluminescência nestas famílias, e se a bioluminescência tem uma origem em comum nas três famílias. O projeto tem como objetivos continuar a análise comparativa da origem bioquímica e anatômica da bioluminescência em larvas de Elateroidea, iniciada por nosso grupo com as larvas de Aspisoma lineatum (Lampyridae) (Viviani et al., 2008). Sera investigada a expressão de luciferase e luciferina no corpo gorduroso e lanternas de algumas espécies-alvo da família Lampyridae (Aspisoma lineatum) e Elateridae (Pyrearinus termitilluminans), analisada a distribuicao subcelular de luciferina, e clonadas as luciferases do corpo gorduroso e das lanternas de larvas de Aspsioma lineatum. (AU)

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