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Estudo da função de Ric-8B na ativação de mTOR usando um modelo olfatório

Processo:17/00726-2
Linha de fomento:Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
Vigência: 01 de junho de 2017 - 31 de maio de 2018
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Bettina Malnic
Beneficiário:
Supervisor no Exterior: Hiroaki Matsunami
Instituição-sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo, SP, Brasil
Local de pesquisa: Duke University (Estados Unidos)
Resumo

In vitro, RIC-8B interage com subunidades ± de proteína G heterotrimérica específicas, atuando tanto como uma chaperona molecular quanto como um fator trocador de nucleotídeos de guanina não-canônico. Trabalhos anteriores do nosso laboratório sugerem que RIC-8B regula a ativação da subunidade G± olfatória, chamada G±olf. G±olf é abundantemente expressa em neurônios olfatórios, onde se acopla a receptores 7-TM específicos e atua na transdução da sinalização de odorantes. Para caracterizar a função de RIC-8B in vivo, produzimos uma linhagem de camundongo mutante para o gene Ric-8B utilizando a estratégia de gene trap. Nossos resultados indicam que RIC-8B é essencial para o desenvolvimento do camundongo e está envolvida no crescimento do embrião e formação do sistema nervoso central embrionário. Através do sequenciamento de transcriptomas de embriões da mesma ninhada, foram identificados os genes diferencialmente expressos entre embrião mutante e embrião selvagem. Esses genes foram posteriormente analisados com o software Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Qiagen), e indicaram que as vias canônicas mais significativamente alteradas no embrião mutante estão relacionadas à síntese proteica, tal como a sinalização de mTOR. mTOR é uma serina/treonina quinase presente em dois complexos multiproteicos distintos que são importantes reguladores do metabolismo, crescimento, proliferação e sobrevivência celular. Experimentos de Western blot com lisados de embrião total indicam que a sinalização de mTOR está reduzida em embriões Ric-8B mutantes. Além disso, em células HEK293T, RIC-8B co-imunoprecipita com mTOR e outras proteínas do complexo. Portanto, nossos resultados sugerem que RIC-8B pode estar relacionada à ativação da sinalização de mTOR, possivelmente através de uma proteína G. Interessantemente, publicações recentes mostram que a ativação de neurônios olfatórios por um odorante está associada à fosforilação da proteína ribossomal S6. Fosfo-S6 é um dos produtos mais bem caracterizados da sinalização de mTOR. Dessa maneira, esse projeto tem como objetivo estudar a função de RIC-8B na ativação de mTOR utilizando o modelo de transdução de odorantes, que já está bem estabelecido. (AU)

Resumo

O desencadeamento de memórias autobiográficas altamente vívidas, detalhadas e afetivas evocadas por odores é conhecido como Fenômeno Proust ou Efeito Madeleine referindo-se à obra "Em Busca do Tempo Perdido: No Caminho de Swann", do escritor Marcel Proust (Edição Original de 1913), que descreve como o odor de um biscoito madeleine mergulhado em chá de tília desencadeia lembranças vívidas e emocionais da infância do personagem principal. Além da forte associação de aromas com a memória emocional individual, o olfato pode proporcionar o desencadeamento de memórias coletivas induzindo recordações que nos tornam conscientes da nossa própria identidade particular e cultural. Apesar do aumento do número de pesquisas relacionadas à evocação de memórias emocionais pelo olfato, ainda não existem estudos mapeando e analisando esse fenômeno em uma população. O objetivo deste estudo é o desenvolvimento e a aplicação de um questionário que será utilizado como meio para a investigação e caracterização da memória emocional olfativa da população brasileira. Além disso, serão analisados níveis de consciência olfativa da amostra estudada e avaliadas possíveis correlações entre os resultados obtidos. (AU)

Resumo

Identificar as regiões genômicas subjacentes à radiação adaptativa de insetos, é um dos principais objetivos da biologia evolutiva moderna. O surgimento do parasitismo obrigatório na família Calliphoridae têm sido tema de debate científico há mais de meio século, gerando a necessidade de estudos sobre como a arquitetura genômica está associada a transições ecológicas adaptativas. Estudos anteriores sugeriram que essa estratégia surgiu duas vezes na linhagem de Calliphoridae, possivelmente para evitar competição por recursos. Contudo, as bases moleculares subjacentes à transição de um hábito saprófago para um hábito parasítico obrigatório nessas espécies permanecem desconhecidas. Nosso grupo de pesquisa acredita que o olfato poderia ter desempenhado um papel crítico nesta adaptação. Para iniciar essa investigação, este projeto propõe a caracterização funcional do co-receptor olfativo Orco da mosca da bicheira, Cochiomyia hominivorax, usando o mais novo e poderoso sistema de edição-genômica CRISPR/Cas9 para nocautear este gene. Orco codifica um co-receptor que dimeriza com todos os Receptores de Odor (ORs) sendo necessário para a via de percepção olfativa mediada pelos ORs. Após nocautear o gene ChomOrco, iremos estabelecer uma linhagem mutante estável, que carece funcionalmente da família gênica ORs. Este projeto objetiva principalmente o estabelecimento do sistema CRISPR para a espécie C. hominivorax, fornecendo também informações importantes sobre os estímulos olfativos associados ao parasitismo em Calliphoridae, gerando o primeiro perfil de respostas mediadas pelos receptores olfatórios em C. hominivorax. (AU)

Resumo

O sistema olfatório controla uma série de mudanças endócrinas e comportamentais em mamíferos, inclusive em humanos. É conhecido que a fertilidade de fêmeas é controlada por hormônios produzidos em áreas do cérebro com estreita relação com o sistema olfatório, incluindo os neurônios produtores do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH). No entanto, não são conhecidos os mecanismos através dos quais a olfação e as informações químicas detectadas pelo organismo são capazes de controlar a fertilidade. Resultados publicados por outros grupos indicam que certas condições de contexto social (por exemplo, o agrupamento de fêmeas em um mesmo ambiente) são capazes de gerar alterações no ciclo reprodutivo em roedores, especialmente no ciclo estral, reduzindo sua fertilidade. Nossa hipótese central é que o sistema olfatório possui células especializadas que detectam feromônios femininos produzidos em contextos sociais específicos, levando à ativação ou inibição dos neurônios GnRH-positivos e, consequentemente, à modulação da fertilidade. Esta hipótese será objetivamente testada em experimentos nos quais fêmeas serão expostas a diferentes contextos sociais (agrupamento em diferentes tamanhos populacionais) seguido da investigação de parâmetros de fertilidade, bem como da ativação de órgãos olfatórios e neurônios produtores de GnRH no cérebro. Este projeto contribuirá para a compreensão de como a olfação controla a fertilidade feminina e de como o ambiente social influencia o caráter sexual e reprodutivo, assunto de grande relevância para a sociedade. Além disso, o entendimento de como a fertilidade é modulada pelos sistemas sensoriais pode revelar como os organismos detectam informações do ambiente para regular, de forma controlada, a reprodução e o tamanho populacional, uma característica evidentemente adaptativa. (AU)

Resumo

O reconhecimento de emoções através de expressões faciais é um processo que envolve a integração de informações de contexto e pode sofrer influência de reações emocionais. Postura corporal e estímulos visuais do ambiente, por exemplo, podem desencadear reações emocionais que interferem na identificação da emoção demonstrada na expressão facial. O olfato é capaz de desencadear alterações no sistema nervoso periférico, e sua neuroanatomia é entrelaçada com áreas do encéfalo responsáveis pelo processamento emocional. Estudos nesta área demonstraram que os estímulos olfativos podem influenciar o reconhecimento de expressões faciais, principalmente de expressões de baixa intensidade (com teor emocional sutil). Odores agradáveis podem facilitar a identificação de expressões de felicidade e dificultar o reconhecimento de expressões de aversão, e a reação inversa acontece com estímulos olfativos desagradáveis. Uma das hipóteses elaboradas pelos pesquisadores é que tal influência ocorra devido ao efeito de feedback facial. As reações da musculatura da face, em resposta ao estímulo olfatório, interferem no reconhecimento das expressões. O objetivo do presente estudo é avaliar o desempenho e as respostas periféricas (condutância da pele, frequência cardíaca e atividade dos músculos corrugador e zigomático maior) da amostra em uma tarefa de reconhecimento de expressões faciais sob estimulação olfativa. Serão apresentados três tipos de odores e uma condição controle (sem odor) durante o experimento, para avaliar o desempenho e as respostas do sistema nervoso periférico em cada condição. (AU)

Resumo

Odorantes são reconhecidos por receptores olfatórios (ORs), presentes nos cílios dos neurônios olfatórios da cavidade nasal. Os ORs pertencem à superfamília de receptores acoplados à proteína G (GPCRs), e constituem uma grande família composta por aproximadamente 1000 genes em camundongos e 400 genes no homem. No presente projeto pretendemos analisar dois aspectos relativos ao funcionamento destes receptores: (1) Os ORs são expressos de maneira monogênica e monoalélica nos neurônios olfatórios. Estes neurônios apresentam uma arquitetura nuclear singular, que parece ser fundamental para a regulação de expressão dos genes que codificam para os ORs. Analisaremos o papel de marcas de histonas específicas (como H3K27me3) e de RNAs não codificadores na organização espacial dos genes de receptores olfatórios no núcleo dos neurônios olfatórios. (2) Durante o processo de transdução de sinal de odorantes, os ORs acoplam-se a uma proteína Galpha olfatória específica, denominada de Galphaolf. Em trabalhos anteriores nós identificamos uma proteína, denominada Ric-8B, que atua como um GEF (fator trocador de GTP) sobre a Galphaolf in vitro. A análise de camundongos knockout para Ric-8B indicaram que este gene é essencial para a embriogênese, e que os embriões knockout apresentam função de mTOR reduzida. Pretendemos investigar como a Ric-8B interfere com o funcionamento de mTOR, do ponto de vista molecular. Obtivemos também animais com deleção do gene de Ric-8B apenas no epitélio olfatório (knockout tecido específico), e, portanto, viáveis. Resultados recentes mostraram que no epitélio olfatório knockout, os neurônios olfatórios não expressam a proteína Galphaolf, e morrem com maior frequência do que no epitélio selvagem. Pretendemos analisar estes animais knockout quanto às vias de sinalização que estão alteradas, e assim compreender as funções desempenhadas por Ric-8B. (AU)

Resumo

Os receptores olfatórios (ORs) atuam na primeira etapa do reconhecimento de odorantes. Camundongos apresentam cerca de mil genes que codificam para os ORs, mas apenas um alelo de um desses genes é expresso em cada neurônio olfatório. Os mecanismos que regulam este peculiar padrão de expressão ainda não são bem compreendidos. Este projeto visa estudar regiões regulatórias dos genes OR por meio de busca de sequências conservadas entre essas regiões, a partir de ferramentas computacionais para motivos de ligação e de comparação com dados de transcriptomas. Os resultados obtidos serão posteriormente validados através de ensaios EMSA (electrophoretic mobility shift assay). (AU)

Resumo

A colonização do colmo de cana-de-açúcar por fungos oportunistas, como Fusarium verticillioides e Colletotrichum falcatum, que resultam na 'podridão vermelha', geralmente ocorre após o ataque de lagartas de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Estudos em andamento conduzidos por nosso grupo de pesquisa, tem demonstrado uma importante ação sinérgica entre D. saccharalis e estes fungos em cana-de-açúcar. Resultados anteriores sugerem que lagartas de D. saccharalis propiciam um ambiente favorável à infecção de C. falcatum em cana-de-açúcar, aumentando significativamente as concentrações do fungo nas plantas atacadas pela broca. Além disso, ambos os fungos, C. falcatum e F. verticillioides exercem um duplo efeito sobre as lagartas, seja promovendo uma forte atração sobre os insetos, seja aumentando sua alimentação e ganho de peso em dietas suplementadas com estes fungos. Um ensaio de escolha olfativa mostrou que D. saccharalis foi atraída por compostos químicos voláteis emitidos por C. falcatum e F. verticillioides, destacando-se acoradiene e acorenol (manuscrito em preparação). A partir deste conhecimento, o presente projeto tem como objetivo identificar e caracterizar receptores olfativos em lagartas de D. saccharalis responsivos aos compostos em estudo. Para esta abordagem serão utilizadas técnicas como sequenciamento de última geração para identificação das sequências e dos perfis de expressão dos genes que codificam receptores olfativos presentes nas antenas das lagartas; identificação e caracterização dos receptores ativos responsivos aos compostos voláteis fúngicos pela clonagem e expressão destes genes em oócitos de Xenopus laevis e; validação dos resultados obtidos por meio da redução da expressão gênica/silenciamento via RNAi em lagartas, seguida de ensaio de escolha olfativa. Esse novo desafio irá decifrar mais uma etapa da complexa rede de interação planta-inseto-fungo, além de poder revelar importantes alvos para o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas de controle de D. saccharalis. (AU)

Resumo

Muitos exemplos de polimorfismo floral já foram descritos para orquídeas polinizadas por engano generalizado de alimento. A alta variabilidade nos atributos florais em sistemas de polinização por engano foram interpretados como um mecanismo que perturba o processo de aprendizado dos polinizadores. Muitos estudos buscaram entender o papel do polimorfismo de cor, mas estudos experimentais focando em como a variação da fragrância floral atua no engano são raros. A abelha Apis mellifera é um modelo adequado para abordar experimentalmente esse problema, devido à possibilidade de treinar e testar os estímulos olfativos em condições laboratoriais controladas. O condicionamento olfativo da resposta de extensão da probóscide (PER) é uma forma efetiva e robusta de condicionamento pavloviano em que abelhas aprendem a associar odores e recompensas de açúcar, o que ajuda a entender como abelhas percebem e discriminam fragrâncias florais. Neste projeto, propomos uma série de experimentos comportamentais usando o condicionamento olfativo PER para entender como a variação na fragrância floral de Ionopsis utriculariodies, uma orquídea brasileira polinizada por engano, atua no aprendizado, generalização e discriminação de odores pelas abelhas. Desta forma, pretendemos caracterizar o papel da variação da fragrância floral na polinização por engano. (AU)

Resumo

O objetivo deste estudo foi identificar regiões genômicas e vias metabólicas associadas com o consumo de matéria seca, ganho médio diário, a eficiência alimentar e consumo alimentar residual em uma população experimental de gado Nelore. O foi usado o Snp chip de alta densidade (Ilumina-Alta Densidade bovino BeadChip, 777k) para genotipar os animais. Os efeitos de marcadores SNP e suas variâncias foram estimadas utilizando o método de associação ampla de passo único do genoma (ssGWAS). Os componentes de (co) variância foram estimados por inferência Bayesiana. Os segmentos de cromossomos que são responsáveis por mais de 1,0% da variância genética aditiva foram selecionados para explorar e determinar possíveis loci de características quantitativas. O Map Viewer do genoma bovino foi utilizado para identificar os genes. No total, foram identificadas 51 regiões genômicas para todas as características analisadas. A herdabilidade estimada para eficiência alimentar foi de baixa magnitude (0,13 ± 0,06). Para o ganho médio diário, consumo de matéria seca e consumo alimentar residual, herdabilidade foi moderada a alta (0,43 ± 0,05; 0,47 ± 0,05, 0,18 ± 0,05, respectivamente). Um total de 8, 18, 14 e 12 janelas que são responsáveis por mais de 1% da variância genética aditiva para o consumo de matéria seca, ganho médio diário, conversão alimentar e consumo alimentar residual, respectivamente, foram identificados. Genes candidatos GOLIM4, RFX6, CACNG7, CACNG6, CAPN8, CAPN2, AKT2, GPRC6A e GPR45 que estão associados com características de eficiência alimentar. Espera-se que a resposta para seleção seja mais elevado para consumo alimentar residual do que para a eficiência alimentar. Foram identificadas regiões genômicas que abrigam possíveis QTL para características indicadoras de eficiência de alimentar. Genes candidatos identificados estão envolvidos no uso de energia, metabolismo de proteína metabolismo, transporte de íons, transporte transmembranar, o sistema olfativo, o sistema imunológico, secreção e atividade celular. A identificação destas regiões e os seus respectivos genes candidatos devem contribuir para a formação de uma base genética em bovinos Nelore para características indicadoras de eficiência da alimentar, e estes resultados apoiaria a seleção para essas características. (AU)

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