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Resumo

A mitocôndria é um componente vital no metabolismo energético e nos processos de sinalização intracelular que regulam sobrevivência e morte celular, ao passo que a disfunção mitocondrial assume papel central no desenvolvimento e progressão de inúmeras doenças, como a cardiopatia isquêmica, principal causa de morte no mundo. Assim, essa organela tem se tornado um atrativo alvo terapêutico para o tratamento das doenças cardiovasculares. Recentemente, uma nova classe de comunicação transmitida pela mitocôndria para regular processos celulares vem ganhando destaque na literatura: os peptídeos derivados da mitocôndria (MDP). De fato, MDP são gerados durante a disfunção mitocondrial induzida pela perda da proteostase dessa organela, e iniciam uma cascata de sinalização na tentativa de manter a homeostase perante estímulos estressores. Assim, estudos exploratórios que identifiquem peptídeos mitocondriais bioativos e caracterizem sua possível participação em diferentes condições fisiopatológicas são essenciais para o entendimento da biologia celular e para o desenvolvimento de novas terapias. Além disso, considerando que a síntese de proteínas codificadas pelo DNA mitocondrial (mtDNA) ocorre como nos procariotos, onde o primeiro aminoácido carregado no ribossomo é a metionina com o grupo formil, acreditamos que, assim como as bactérias, as mitocôndrias disfuncionais possam se comunicar com o organismo em diferentes níveis (ações parácrina e autócrina) por meio da liberação de peptídeos formilados oriundos de proteínas codificadas pelo mtDNA.Estudos conduzidos por nosso grupo de pesquisa e outros grupos têm apontado a mitocôndria como organela-chave na propagação do dano cardíaco durante o processo de isquemia/reperfusão (IR) e a progressão da disfunção cardíaca em diferentes cardiomiopatias. Além disso, em estudo piloto observamos prejuízo na proteostase mitocondrial e consequente acúmulo de peptídeos na fração mitocondrial de corações de ratos submetidos à IR ex vivo. Em seguida, realizamos uma análise peptidômica associada à espectrometria de massa e identificamos nas amostras submetidas à IR um único peptídeo formilado, oriundo de uma proteína do genoma mitocondrial. Sintetizamos esse peptídeo e testamos seu efeito biológico em linhagem de mioblastos cardíacos, e observamos um importante papel desse peptídeo sintético em prevenir a morte celular induzida pela hipóxia/reoxigenação (HR) in vitro. Esses resultados preliminares dão suporte a nossa hipótese de que peptídeos formilados mitocondriais agem como moléculas sinalizadoras no processo de IR, e abrem um novo campo de investigação para o entendimento da biologia celular e para o desenvolvimento de novas terapias para as doenças isquêmicas do coração.Assim, pretendemos no presente estudo exploratório compreender o papel dos peptídeos formilados mitocondriais como moléculas sinalizadoras no processo de IR cardíaca. Esse estudo torna-se interessante e de grande valia uma vez que a compreensão detalhada do papel dos peptídeos formilados mitocondriais na IR poderá contribuir para o futuro emprego de terapias que atuem em mecanismos-chave envolvidos na fisiopatologia do infarto agudo do miocárdio e das doenças isquêmicas em geral. Nesse projeto contaremos com um grupo internacional multidisciplinar e multicêntrico, envolvendo os seguintes pesquisadores: Dra. Daria Mochly-Rosen (Stanford University-EUA); Dr. Emer Suavino Ferro (ICB-USP); e Dr. Alexander Van der Bliek (UCLA-EUA). (AU)

Resumo

O retículo endoplasmático (RE) é uma organela dinâmica responsável pela síntese, modificação, dobramento e transporte de proteínas secretoras e membranares, bem como o armazenamento de Ca2+ e a biossíntese lipídica. Além disso, o ER tem locais de contato com a membrana mitocondrial externa (mitochondrial-associated membranes, MAM), que é de grande importância para a regulação do metabolismo lipídico e a sinalização de Ca2+. Assim, a MAM influência o metabolismo energético, a proliferação celular, a autofagia e a apoptose. Por isso, alterações nas MAMs podem resultar em várias síndromes metabólicas (i.e., obesidade e diabetes) e neurodegenerativas (i.e., Alzheimer e Parkinson). Apesar de muitos estudos estarem emergindo sobre a função e a caracterização da MAM, algumas questões permanecem obscuras, como quais os sinais intracelulares que promovem a MAM, quais proteínas estão envolvidas no tethering ER-mitocôndria e como a MAM pode influenciar na homeostase celular. A mitofusina 2 (Mfn2) foi a primeira proteína caracterizada como envolvida na formação da MAM. Recentemente, descobrimos que o nocaute condicional de Mfn2 afeta sutilmente o desenvolvimento de oócitos, levando a alteração do metabolismo da glicose na progênie. Em contrapartida, dados preliminares relacionaram a Leucine Repeats Rich Kinase 2 (LRRK2) à MAM, com possíveis implicações para o desenvolvimento da doença de Parkinson (PD). Assim, pretendemos com este trabalho abordar o papel de Mfn2 e LRRK2 sobre o tethering ER-mitocôndria. Especificamente, iremos avaliar i) a morfologia do ER e da mitocôndria, assim como o tethering entre essas organelas, em oócitos murinos nocaute para Mfn2; ii) se LRRK2 está na interface ER-mitocôndria em fibroblastos embrionários murinos (MEFs); e, iii) se os mutantes PD LRRK2 alteram o tethering e a comunicação entre mitocôndria e ER. Esperamos com estes experimentos fornecer novas evidências que relacionem Mfn2 e LRRK2 com o desenvolvimento de doenças metabólicas e neurodegenerativas, respectivamente. (AU)

Resumo

A obesidade tem alcançado proporções epidêmicas em todo o mundo, especialmente em áreas urbanas. Embora, a prevalência da obesidade venha se expandindo de forma progressiva para ambos os sexos, em 2014 o número de mulheres obesas, incluindo aquelas em idade fértil, excedeu o de homens na mesma condição em todas as regiões da OMS. A obesidade materna está associada a alterações importantes no metabolismo da prole, favorecendo o risco do desenvolvimento de doenças metabólicas de relevante incidência, como o diabetes mellitus. Durante a vida fetal, órgãos e tecidos apresentam um intenso processo de formação e divisão celular e tal fase é definida como um período essencial para o desenvolvimento humano. Estímulos, carências ou danos ocorridos durante esse crítico período induzem alterações permanentes na saúde do indivíduo, comprometendo função e estrutura celulares. Nesse contexto, o hipotálamo apresenta papel fundamental no controle da homeostasia glicêmica através da resposta aos nutrientes consumidos e, por tal motivo, é considerado componente chave na regulação dos efeitos da obesidade sobre o metabolismo energético. Adicionalmente, a obesidade materna tem sido relacionada frequentemente ao elevado ganho de peso pela prole, implicando em distúrbios na regulação central da ingestão alimentar como consequência da programação fetal. O mecanismo epigenético está entre os mais importantes processos moleculares relacionados à programação metabólica e desenvolvimento de doenças pela prole. Componentes importantes da regulação epigenética, os microRNAs estão envolvidos em processos biológicos cruciais, entre eles a regulação do metabolismo. Sendo assim, a proposta do presente projeto é identificar e investigar a participação dos microRNAs nas alterações causadas pela obesidade materna sobre os circuitos neuronais de controle da fome na prole e delinear as vias metabólicas centrais afetadas. Identificadas vias e os microRNAs potencialmente envolvidos, propor novos pontos de intervenção e terapêutica. Para isso serão utilizadas as técnicas de RNA-seq, proteômica-SILAC, análise in silico e transfecção in vitro para ensaio de reporter com luciferase. Tal projeto contribuirá para a compreensão dos mecanismos moleculares que conectam a obesidade materna a distúrbios funcionais do hipotálamo na prole, focando na participação de microRNAs e das vias por eles reguladas. (AU)

Resumo

Esquizofrenia é um distúrbio severo e debilitante que afeta aproximadamente 1% da população mundial. Representa uma síndrome complexa que acredita-se ter origem no neurodesenvolvimento e se manifesta por uma gama variada de sintomas graves. Diversos estudos proteômicos, farmacológicos e genéticos foram realizados com o intuito de tentar elucidar os mecanismos associados à doença e reportaram anormalidades no funcionamento mitocondrial e metabolismo energético em esquizofrenia. Interessantemente, o antipsicótico Clozapina, que apresenta uma expressiva eficácia clínica, revelou-se como sendo capaz de melhorar a captação de glicose em oligodendrócitos, indicando que além de rebalancear a neurotransmissão, esse medicamento age no metabolismo energético dessas células, o que pode por sua vez aprimorar a conectividade neuronal. Dentre as diversas proteínas relacionadas ao metabolismo energético encontradas alteradas na esquizofrenia, a subunidade alfa do componente E1 da piruvato desidrogenase se destaca, já que é uma proteína mitocondrial que representa a primeira ligação entre a glicólise e o ciclo do ácido cítrico, por converter piruvato em acetil-CoA. Essa evidência em conjunto com relatos que pacientes com esquizofrenia apresentam níveis diminuídos de piruvato em algumas regiões cerebrais revela que uma falha generalizada no metabolismo energético é uma característica importante da esquizofrenia. O uso de leveduras para modelar disfunções no metabolismo energético é de extremo valor uma vez que o proteoma humano e de levedura são tão similares que o uso de leveduras é apropriado para a determinação dos efeitos primários na transdução de energia mitocondrial e fisiologia de mutações ligadas à doença. A técnica de Crispr/Cas9 revolucionou o campo de edição e expressão de genes, uma vez que permite a deleção e/ou substituição eficiente de genes inteiros sem a necessidade de engenharia de proteínas. Tendo isso em mente, nós propomos realizar um knock-out genético usando a técnica de Crispr/Cas9 do gene da subunidade alfa do componente E1 da piruvato desidrogenase em Saccharomyces cerevisiae e avaliar os efeitos deste knock-out no metabolismo energético celular antes e após o tratamento com Clozapina. O conhecimento da ferramenta de Crispr/Cas9 adquirido será de extrema importância para trazer essa técnica para nosso laboratório no Brasil e para implementar protocolos e um local para execução de projetos futuros utilizando Crispr/Cas9 em diferentes modelos celulares, como leveduras e células-tronco de pluripotência induzida. (AU)

Resumo

Mitocôndrias desempenham papeis fundamentais tanto no metabolismo energético quanto em sinalização em células eucarióticas. Essas organelas são responsáveis pela produção de ATP, e desempenham funções centrais na sinalização redox, homeostase de cálcio e sinalização apoptótica. Um aspecto particular da biologia mitocondrial é que essas organelas contêm um genoma próprio, independente do genoma nuclear. Em humanos, o genoma mitocondrial (mtDNA) contem 16.569 pares de bases e codifica 13 proteínas, 2 rRNAs e 22 tRNAs. A estabilidade do mtDNA é essencial para a integridade funcional da organela e da célula, e mutações nesse genoma estão associadas com várias doenças. No entanto, o genoma mitocondrial está exposto a vários agentes genotóxicos, incluindo espécies reativas de oxigênio geradas normalmente como subprodutos do transporte de elétrons durante a fosforilação oxidativa. De fato, o mtDNA acumula lesões de DNA em níveis maiores do que o genoma nuclear. Desta forma, o entendimento dos mecanismos envolvidos na manutenção da estabilidade genética e funcional do mtDNA é fundamental para a melhor compreensão de processos fisiológicos e/ou patológicos. Esse projeto é subdivido em 5 subprojetos que abordam desde aspectos moleculares dos mecanismos de manutenção da integridade do mtDNA até a relevância funcional desses em patologias humanas. Esses são: 1) estudo dos mecanismos moleculares de reparo de DNA em mitocôndrias de mamíferos; 2) estudo do papel de proteínas de replicação na estabilidade do mtDNA; 3) estudo do papel de Rad51 mitocondrial na linhagem germinativa feminina e na fertilidade; 4) estudo da heterogeneidade do mtDNA em carcinoma renal; e 5) investigação de defeitos na manutenção do mtDNA em pacientes com intolerância ao exercício. Os resultados obtidos aqui devem avançar significativamente o entendimento molecular dos mecanismos de manutenção da estabilidade genômica em mitocôndrias, bem como da participação de alterações nessas vias em processos patológicos, e assim podem contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas ou preventivas. (AU)

Resumo

Distúrbios psiquiátricos representam um grande desafio medico e social e pessoas que sofremdessas condições se deparam com muitos obstáculos tanto na vida pessoal quantoprofissional. Além disso, doenças mentais se manifestam em aproximadamente um quarto dapopulação mundial em algum período da vida. Disfunção no metabolismo energético é um dosachados científicos mais recorrentes associados a esses distúrbios. Com isso em mente, essarevisão compilou dados sobre distúrbios no metabolismo energético revelados por análisesproteômicas de tecido cerebral coletado post-mortem de pacientes afetados pelas doençaspsiquiátricas mais prevalentes: esquizofrenia (EZQ), transtorno bipolar (TBH) e transtornodepressivo maior (TDM). Nós buscamos no banco de dados PubMed para reunir os estudos ecompilamos todas as proteínas diferencialmente expressas reportadas em cada trabalho.Estudos de EZQ revelaram 92 proteínas diferencialmente expressas relacionadas aometabolismo energético, enquanto 95 proteínas foram encontradas em TBH e 41 proteínas emTDM. Com a compilação dos dados, foi possível determinar quais proteínas relacionadas aometabolismo energético foram encontradas alteradas em todas as doenças assim como quaisestão alteradas exclusivamente em uma delas. Concluindo, as informações reunidas nessetrabalho podem contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos metabólicosalterados e potencialmente trazer novas percepções sobre a neuropatologia de doençaspsiquiátricas. (AU)

Resumo

A obesidade tornou-se uma pandemia mundial e é caracterizada por um desequilíbrio energético a favor da acúmulo de energia pelo tecido adiposo branco (TAB). A obesidade é um fator de risco para várias doenças. O papel principal do TAB é acumular energia como gordura, por outro lado, o tecido adiposo marrom (TAM) contribui para o gasto energético pela produção de calor. A ativação da proteína termogênica UCP1 no TAM, desacoplam a fosforilação oxidativa, dissipando a energia como calor. O TAM é considerado um alvo importante na batalha da perda do peso. Embora existam muitas drogas para combater a obesidade e doenças metabólicas, vários estudos têm sido realizados a fim de trazer novas terapias para a prevenção e tratamento da obesidade. Neste cenário, estudos recentes demonstraram o papel da adenosina como uma importante molécula de sinalização nos tecidos relacionados ao gasto energético. A adenosina quinase (ADK) é uma das principais enzimas no metabolismo da adenosina. A sinalização de adenosina tem sido associada a uma melhora no processo inflamatório e homeostase energética em modelos de roedores obeso. Estudos recentes indicam a adenosina como uma importante molécula de sinalização no TAM, promovendo maior gasto energético. Além disso, a adenosina também pode participar na diferenciação do TAB a TAM. Portanto, o objetivo deste estudo é investigar o novo inibidor farmacológico da enzima ADK no metabolismo energético de camundongos obesos, com ênfase em estudo in vitro de adipócitos humanos e de roedores. Este inibidor pode ser um novo aliado para o tratamento da obesidade, agindo sobre o gasto energético. (AU)

Resumo

O lagarto sul-americano, Salvator merianae apresenta ciclos anuais de elevada atividade durante a primavera e verão e hibernação durante o inverno, um ritmo sazonal que é independente da temperatura ambiente (Ta). Além disso, durante a estação reprodutiva, a primavera, esse animal é capaz de manter a temperatura corporal (Tc) acima da Ta por produção endógena de calor, sendo portanto, um lagarto endotérmico facultativo. S. merianae é, assim, especialmente importante como modelo experimental para investigação de mecanismos envolvidos em variações sazonais fisiológicas e comportamentais e para trazer insights para a evolução da endotermia. Entretanto, os mecanismos envolvidos em tais diferenças sazonais endógenas ainda não são conhecidos e os primeiros candidatos a serem investigados são os hormônios com ação sobre o metabolismo energético (hormônios tireoidianos) e com a reprodução (esteroides gonadais). Diante disso, o objetivo do presente projeto será avaliar no lagarto S. merianae as relações das alterações sazonais dos hormônios tireotropina (TSH), T3, T4, testosterona e estradiol com as mudanças sazonais da atividade e da Tc num mesmo indivíduo ao longo de um ano. Conhecer os mecanismos envolvidos em ajustes fisiológicos em ambientes sazonais é imprescindível para entender a capacidade de uma espécie em acompanhar as alterações de curto-prazo do ambiente, tal como os impactos que as mudanças climáticas podem apresentar sobre uma população animal. Assim, nossa hipótese é que as alterações endócrinas precederão as alterações comportamentais e metabólicas, ou seja, a redução nas concentrações plasmáticas dos hormônios tireoidianos serão relacionadas com a diminuição da atividade motora durante a hibernação, independente da Tc, e aumento nas concentrações plasmáticas de hormônios tireoidianos e sexuais precederão os aumentos na atividade motora e termogênese durante a fase reprodutiva pós-hibernação. Para testar essa hipótese, cada animal adulto (machos e fêmeas) individualmente identificado terá implantado na cavidade celomática sensores/armazenadores de temperatura (medidas de temperatura corporal a cada 70 min) e fixado um colar contendo um sensor de atividade (acelerômetro) para medidas contínuas tridimensionais de atividade motora (frequência de amostragem 1 Hz) que permanecerão por um ano inteiro, enquanto serão feitas colheitas mensais de sangue para as dosagens hormonais. Os animais serão mantidos em habitat seminatural sob influência das alterações naturais de temperatura e fotoperíodo. (AU)

Resumo

Neurônios que co-expressam o neuropeptideo Y (NPY) e a proteína relacionada agouti (AgRP) estão localizados na parte ventromedial do núcleo arqueado do hipotálamo (ARH). Esses neurônios, vias os neuromodulares expressos por eles, são os mais potentes estimuladores do apetite. O hormônio do crescimento (GH) age sobre tecidos periféricos e está diretamente relacionado com várias funções do organismo como, o controle do metabolismo, crescimento somático e processos celulares. O hormônio liberador de GH, a somatostatina, além dos ácidos graxos livres, leptina, grelina e o neuropeptideo Y, são importantes fatores que controlam a secreção hipofisária de GH. Também o estado nutricional, a atividade física intensa, o estresse, a hipoglicemia e o jejum são potentes reguladores de sua liberação. Existem evidências que o GH pode exercer efeitos sobre o Sistema Nervoso Central (SNC), principalmente na regulação do apetite, cognição, memória, sono, proteção neural e bem estar. Nosso grupo de pesquisa realizou recentemente mapeamento detalhado da distribuição de células responsivas ao GH no SNC de camundongos. Os resultados desse estudo indicaram a presença numerosa de células responsivas ao GH em várias áreas cerebrais, estando em destaque regiões envolvidas com o controle do metabolismo energético e glicêmico. A grande presença de células responsivas ao GH no ARH não garante a presença do receptor de GH (GHR) em todos os grupamentos neuronais que formam esse núcleo. Contudo, alguns trabalhos indicaram que 95% dos neurônios NPY/AgRP do ARH apresentam expressão do GHR (Kamegai et al., 1996). A fim de ter condições de estudar a ação do GH especificamente em neurônios NPY/AgRP do ARH, iremos utilizar o sistema Cre-LoxP que permite a manipulação gênica de maneira tecido-específica. Assim, iremos produzir camundongos que apresentam inativação do GHR exclusivamente em neurônios NPY/AgRP do ARH. Esses animais serão estudados quanto a possíveis alterações no controle do balanço energético, na homeostase glicêmica e durante situações que produzem aumento fisiológico do GH, para que possamos investigar a importância da sinalização de GH em neurônios NPY/AgRP do ARH. Os nossos resultados podem indicar pela primeira vez um possível efeito do GH no sistema nervoso central para o controle de aspectos metabólicos. Esses efeitos seriam mediados pelos neurônios NPY/AgRP do ARH, especializados em integrar informações de diferentes hormônios para o controle do metabolismo. (AU)

Resumo

Mitocôndrias têm papel fundamental no crescimento do oócito, podendo, em casos de disfunções ou mutações no DNA mitocondrial (mtDNA), resultar em síndromes de infertilidade e transmissão de doenças mitocondriais. Comparado com outras células, as mitocôndrias oocitárias distinguem-se pela maior quantidade, pequeno tamanho e formato arredondado. Tais características são dependentes da fusão e fissão mitocondrial, o que é determinante para a função e herança da organela. A fusão mitocondrial é coordenada, entre outros fatores, por mitofusinas (Mfn1 e Mfn2). Estas proteínas desempenham importante papel na regulação da função da mitocôndria e do retículo endoplasmático (RE), uma vez que o Mfn2 também está presente na membrana do RE. Recentemente, verificamos que o Mfn1 é essencial para o crescimento e fertilidade do oócito, fenótipo este que foi parcialmente revertido pelo nocaute do Mfn2 em oócitos duplo-mutantes (DM). Por outro lado, a deficiência oocitária de Mfn2 interferiu sobre a eliminação do mtDNA mutante NZB/BINJ (NZB) e resultou em anormalidades metabólicas na progênie. Assim, propomos neste trabalho aprofundar esses achados com o objetivo de explicar i) o mecanismo molecular que conecta o nocaute do Mfn1 no oócito ao bloqueio da foliculogênese; ii) o efeito do nocaute do Mfn2 sobre o metabolismo energético no oócito, nas células do cumulus (CC) e na progênie; iii) as razões do duplo mutante Mfn1 + Mfn2 (DM) ter efeito mais brando sobre o desenvolvimento do oócito e a foliculogênese do que o nocaute do Mfn1; e, iv) o papel do Mfn2 na eliminação do mtDNA NZB no oócito. Para tanto, os genes Mfn1 e/ou Mfn2 serão condicionalmente nocauteados nos oócitos utilizando camundongos heteroplásmicos (contendo mtDNA NZB e C57BL/6). Oócitos selvagens (WT) e homozigotos nocautes para Mfn1, Mfn2 e Mfn1 + Mfn2 serão comparados por sequenciamento de RNA (RNAseq) quanto a abundância de transcritos gênicos. Isso deve fornecer importantes evidências dos efeitos dos nocautes sobre o oócito. Além disso, outros experimentos (análises metabólicas, análises bioquímicas, microscopia de fluorescência, microscopia eletrônica de transmissão, PCR em tempo real, western blot, entre outros) serão realizados em paralelo para testar algumas das hipóteses já formuladas. Uma vez que estes experimentos envolverão a análise de oócitos, CC e progênie, espera-se que eles complementem a abordagem por RNAseq e que acelerem a publicação de parte dos achados já obtidos. Os resultados desse projeto devem possibilitar um melhor entendimento do efeito das mitocôndrias, do RE e das mitofusinas sobre o oócito, a fertilidade e a herança mitocondrial. (AU)

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