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Exposição pré-puberal a baixas doses de metilmercúrio e aroclor associados: avaliação de parâmetros reprodutivos e endócrinos de ratos púberes e adultos

Beneficiário:Juliana Elaine Perobelli
Instituição: Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação. Universidade do Sagrado Coração (USC). Bauru, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Juliana Elaine Perobelli
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Morfologia - Histologia
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:13/14477-3
Vigência: 01 de outubro de 2013 - 30 de setembro de 2015
Assunto(s):Toxicologia reprodutivaCapacitação espermáticaCompostos de metilmercúrioBisfenol policloradoPuberdade
Resumo
O metilmercúrio (MeHg) e os bisfenois policlorinados (PCBs) são agentes tóxicos persistentes no ambiente e que sofrem biomagnificação ao longo da cadeia trófica. A principal fonte de exposição da população a estes compostos se dá através do consumo de peixes e frutos do mar contaminados. Muitos estudos epidemiológicos e experimentais tem mostrado que isoladamente estes químicos são neurotóxicos e podem causar efeitos adversos sobre parâmetros reprodutivos e sistema endócrino. No entanto, observa-se uma escassez de estudos que investiguem aspectos reprodutivos e endócrinos após exposição ao MeHg e PCBs associados, principalmente em modelos de exposição durante a pré e peri-puberdade. A exposição durante a infância/pré-puberdade merece atenção especial, pois nesta fase o indivíduo está pela primeira vez em contato direto com os contaminantes ambientais, sem o intermédio do metabolismo materno como acontece durante a gestação e lactação. Frente a isso, o presente estudo propõe investigar se a exposição ao MeHg e Aroclor (mistura comercial de PCBs) associados e em baixas doses durante a fase pré-puberal interfere em parâmetros reprodutivos e endócrinos do rato macho. Serão analisados os testículos, epidídimos e tireoide de ratos machos na puberdade (avaliação imediata) e na idade adulta (avaliação tardia), após 62 dias sem exposição aos químicos. Com os resultados do presente estudo espera-se obter informações mais esclarecedoras sobre as consequências da exposição pré-puberal ao MeHg e Aroclor associados, com foco sobre a saúde reprodutiva, endócrina e qualidade espermática dos animais. (AU)

Avaliação das subpopulações espermáticas no ejaculado de cães, visando a análise de fertilidade e criopreservação

Beneficiário:Carmen Cecilia Sicherle
Instituição: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Maria Denise Lopes
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Processo:13/02050-5
Vigência: 01 de junho de 2013 - 29 de fevereiro de 2016
Assunto(s):CriopreservaçãoSêmen animalFertilidadeCães
Resumo
Este estudo tem como objetivo identificar animais de maior e menor fertilidade e testar seu comportamento frente aos procedimentos de criopreservação através da análise de agrupamentos das subpopulações espermáticas (SE) e de fertilidade. O sêmen será avaliado para a determinação e avaliação de SE através da análise computadorizada da cinética espermática (CASA), da integridade da membrana plasmática, da quantificação de apoptose espermática e pela avaliação da capacitação espermática e reação acrossomal, durante o processo de criopreservação. Serão realizados dois experimentos: no Experimento 1, serão determinadas as SE, durante o processo de criopreservação do sêmen de 5 cães, utilizando quatro ejaculados de cada animal; as análises serão realizadas nos momentos de pós-coleta, pós-refrigeração e pós-descongelação. As avaliações da cinética espermática serão realizadas pelo CASA e a integridade das membranas espermáticas por citometria de fluxo usando uma combinação dos fluorocromos: iodeto de propídio (IP) e aglutinina de Pisum sativum conjugada ao isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA). A apoptose será avaliada pela Anexina-V e a capacitação espermática pela combinação dos fluocromos merocianina-540 (M540) e Yo-Pro 1. Com a análise dos resultados os machos serão separados como os de maior e menor fertilidade (HIF e LOF). Dentre os 5 cães serão escolhidos um (1) HIF e um (1) LOF serão utilizados no Experimento 2. No Experimento 2, as subpopulações de maior potencial fertilizante serão identificadas nos dois cães selecionados no experimento I e avaliadas in vivo por meio da Inseminação Artificial. Para isso o método de separação espermática a ser utilizado será o Gradiente PureSperm® com densidades de 80 e 40 (DOURADO et al. 2011). A inseminação artificial será realizada em um grupo de 20 cadelas para comparação quanto aos resultados de fertilização entre os cães de maior fertilidade (HIFS, n = 10) e o de menor fertilidade (LOFS, n = 10). A inseminação artificial transcervical será realizada com o auxílio de endoscópio rígido para visualização do anel cervical e cateterização. Decorridos 10/12 dias após a ovulação a ováriosalpingohisterectomia (OSH) destas cadelas será feita para a identificação, contagem e avaliação dos embriões. (AU)

Efeito do estresse oxidativo no espermatozóide e relação com o desenvolvimento embrionário

Beneficiário:Letícia Signori de Castro
Instituição: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Mayra Elena Ortiz D' Avila Assumpcao
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Processo:12/22915-8
Vigência: 01 de abril de 2013 - 31 de março de 2015
Assunto(s):EmbriogêneseEstresse oxidativo
Resumo
Tendo em vista a importância do espermatozoide no momento da fecundação e o desenvolvimento embrionário inicial, conhecer o efeito de alterações decorrentes da criopreservação, como a produção das espécies reativas de oxigênio (EROs) e respectivos efeitos nesta célula é fundamental para o aprimoramento de biotécnicas como a produção in vitro de embriões (PIV). Este estudo tem como objetivos avaliar o impacto de diferentes concentrações de agentes indutores de estresse oxidativo sobre o espermatozoide e o efeito deste estresse oxidativo nos estágios iniciais do desenvolvimento de embriões PIV. Em uma primeira fase, espermatozoides tratados e controle serão corados com sondas fluorescentes e avaliados por citometria de fluxo capilar. Variáveis espermáticas relacionadas à estrutura da cromatina (laranja de acridina), potencial mitocondrial (JC-1), integridade de membranas (FITC-PI) e capacitação espermática (clortetraticlina), além dos relacionados ao estresse oxidativo (diacetato de diclorfluoresceína, CellROX®, e C11-BODIPY) serão analisadas nesta fase. Além da citometria de fluxo microcapilar, parte do sedimento será separada para realização do ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs). Em uma segunda fase, os grupos de espermatozoides tratados com agentes indutores de estresse oxidativo e controle serão utilizados na produção in vitro de embriões buscando verificar o impacto de diferentes níveis de estresse oxidativo na fecundação in vitro e no desenvolvimento inicial do embrião. Para isto, os embriões serão avaliados com relação à velocidade de clivagem e formação de pró-núcleo. (AU)

Análise da capacidade de ligação de células espermáticas provenientes do epidídimo às células do oviduto cultivadas in vitro na espécie equina

Beneficiário:José Antonio Dell Aqua Junior
Instituição: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:José Antonio Dell Aqua Junior
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:12/17320-5
Vigência: 01 de novembro de 2012 - 31 de outubro de 2014
Assunto(s):Biotecnologia da reproduçãoEspermatozoides animalProteínas secretadas pelo epidídimoCapacitação espermáticaFertilização in vitro animalEquinos
Resumo
Muitas biotecnologias estão sendo desenvolvidas visando a conservação do material genético de garanhões de alto valor zootécnico, dentre elas podemos destacar a colheita de espermatozóides do epidídimo de animais que sofreram algum trauma ou enfermidade que impossibilitem a colheita do sêmen, óbito ou eutanásia. Porém essas células espermáticas não entram em contato com o plasma seminal, importante por conter proteínas que participam de processos relacionados à proteção e fixação dos espermatozóides nos sítios de ligação dos reservatórios espermáticos na tuba uterina. A colonização dos reservatórios espermáticos no oviduto é um importante fenômeno responsável pela redução do risco de poliespermia por liberar uma quantidade pequena e suficiente de espermatozóides para a fecundação no momento da ovulação e previne a capacitação espermática precoce mantendo em nível basal a concentração intracelular de cálcio. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a capacidade de ligação de células espermáticas provenientes da cauda do epidídimo às células do oviduto cultivadas in vitro na espécie equina. Para isso, serão comparados os parâmetros espermáticos entre espermatozóides in natura e congelados obtidos do ejaculado e da cauda do epidídimo de dez garanhões, os quais serão incubados com células do istimo de éguas cultivadas in vitro. Após o período de incubação, os explantes serão retirados das gotas com o mínimo possível de meio, o volume restante das gotas será aspirado e a concentração de espermatozoides remanescentes será contada. O número de espermatozoides que se ligou será estimado pela subtração do número de espermatozoides após o período de incubação da concentração inicial de espermatozoides. (AU)

Análise da capacidade de ligação de células espermáticas provenientes do epidídimo às células do oviduto cultivadas in vitro na espécie equina

Beneficiário:João Alexandre Matos Carneiro
Instituição: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:José Antonio Dell Aqua Junior
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Processo:12/12526-4
Vigência: 01 de outubro de 2012 - 30 de setembro de 2014
Resumo
Muitas biotecnologias estão sendo desenvolvidas visando a conservação do material genético de garanhões de alto valor zootécnico, dentre elas podemos destacar a colheita de espermatozóides do epidídimo de animais que sofreram algum trauma ou enfermidade que impossibilitem a colheita do sêmen, óbito ou eutanásia. Porém essas células espermáticas não entram em contato com o plasma seminal, importante por conter proteínas que participam de processos relacionados à proteção e fixação dos espermatozóides nos sítios de ligação dos reservatórios espermáticos na tuba uterina. A colonização dos reservatórios espermáticos no oviduto é um importante fenômeno responsável pela redução do risco de poliespermia por liberar uma quantidade pequena e suficiente de espermatozóides para a fecundação no momento da ovulação e previne a capacitação espermática precoce mantendo em nível basal a concentração intracelular de cálcio. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a capacidade de ligação de células espermáticas provenientes da cauda do epidídimo às células do oviduto cultivadas in vitro na espécie equina. Para isso, serão comparados os parâmetros espermáticos entre espermatozóides congelados obitidos do ejaculado e da cauda do epidídimo de dez garanhões, os quais serão incubados com células do istimo de éguas cultivadas in vitro. Após o período de incubação, os explantes serão retirados das gotas com o mínimo possível de meio, o volume restante das gotas será aspirado e a concentração de espermatozoides remanescentes será contada. O número de espermatozoides que se ligou será estimado pela subtração do número de espermatozoides após o período de incubação da concentração inicial de espermatozoides. (AU)

"SPAG11C e GLRX3 no trato reprodutor masculino de ratos: interação proteína/proteína, expressão celular e papel fisiológico"

Beneficiário:Pamella Aparecida Jacon Pelosi
Instituição: Instituto Nacional de Farmacologia (INFAR). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). São Paulo, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Maria Christina Werneck de Avellar
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Geral
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Processo:11/16290-2
Vigência: 01 de março de 2012 - 31 de outubro de 2013
Assunto(s):EpididimoExpressão gênicaProteômica
Resumo
SPAG11 (sperm associated antigen 11) constitui uma família de proteínas que apresentam um domínio específico designado "Sperm antigen HE2" e algumas isoformas apresentam também um domínio de ²-defensinas. Essas proteínas são abundantemente expressas no trato reprodutor masculino, em especial no epidídimo. SPAG11 apresenta atividade antimicrobiana in vitro, além de estar envolvida na maturação e capacitação espermática, sobrevivência do espermatozóide e interação espermatozóide-oócito. Apesar de todas essas funções, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação e função biológica. Através de ensaios de duplo híbrido, detectamos a interação da isoforma SPAG11C com a proteína glutaredoxin 3 (GLRX3). GLRX3 é expressa em vários tecidos, bem como no trato reprodutor. Sua interação já foi descrita com outras proteínas, entre as quais, a MLP (muscle LIM protein), uma proteína abundantemente expressa em músculo e que até o momento teve sua função relacionada com a hipertrofia cardíaca. GLRX3 exerce um efeito indireto na ativação de calcineurina via sua interação com MLP, o que resulta em regressão do processo de hipertrofia induzida do músculo cardíaco. Ainda não dispomos de nenhuma informação sobre o possível papel de SPAG11C em tecidos musculares. Assim, o presente projeto tem como objetivo estudar a interação entre SPAG11C e GLRX3 in vitro, avaliar a expressão no trato reprodutor masculino e em tecidos não reprodutivos de ratos e investigar a possível função celular do complexo SPAG11C/GLRX3 em cultura de cardiomiócitos neonatais, que poderá em uma segunda etapa, ser avaliado em células do trato reprodutor. (AU)

Avaliação dos constituintes protéicos do plasma seminal e sua correlação com a fertilidade de garanhões

Beneficiário:Frederico Ozanam Papa
Instituição: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Frederico Ozanam Papa
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:11/17625-8
Vigência: 01 de março de 2012 - 31 de agosto de 2014
Assunto(s):Sêmen animalCitometria de fluxoEquinos
Resumo
A espécie equina possui reduzidos índices de fertilidade quando comparada com as demais espécies domésticas. Parte dessas observações relaciona-se ao fato de que na equinocultura, não é realizada a seleção dos animais pela fertilidade. Além disso, há tendências de se atribuir à fêmea os problemas de infertilidade, o que compromete uma avaliação mais criteriosa envolvendo o macho. Dentre os fatores que podem alterar os índices reprodutivos, a qualidade seminal assume um efeito considerável. Já foi demonstrado que alguns componentes do plasma seminal estão relacionados com a fertilidade do sêmen bovino, sugerindo que a determinação destes componentes poderia ser considerada uma forma de avaliação do ejaculado. Desta forma, serão comparados parâmetros de cinética espermática, integridade de membrana plasmática e acrossomal, peroxidação lipídica, integridade de DNA, capacitação espermática, valor absoluto do potencial de membrana plasmática e a verificação e quantificação da presença das proteínas semenogelina e osteopontina nos espermatozóides de garanhões férteis e subférteis. Além disso, com o objetivo de identificar as proteínas do plasma seminal de garanhões férteis e subférteis que supostamente estariam correlacionadas com a fertilidade, será realizada a técnica de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa. O isolamento e caracterização das proteínas presentes no plasma seminal podem possibilitar a avaliação de sua influência sobre as células espermáticas e a identificação segura e precoce de garanhões férteis em relação àqueles subférteis. E do mesmo modo, possibilitar o desenvolvimento de novas técnicas que contribuam para o aumento e predição da fertilidade em garanhões. (AU)

Proposta de critérios para o estabelecimento do perfil das subpopulações espermáticas como padrão qualitativo em sêmen ovino criopreservado visando a reprodução assistida

Beneficiário:Sony Dimas Bicudo
Instituição: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Sony Dimas Bicudo
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:11/19081-5
Vigência: 01 de fevereiro de 2012 - 31 de julho de 2014
Assunto(s):Citometria de fluxoSêmen animalCriopreservação animalAntioxidantesOvinos
Resumo
Objetiva-se determinar as subpopulações espermáticas (SE) através de quatro critérios metodológicos (CM) envolvendo o CM1 pela análise computadorizada da cinética espermática (CASA - 5 SE), o CM2 pela avaliação da integridade da membrana plasmática e a reação acrossomal (4 SE), o CM3 pela quantificação de apoptose espermática (4 SE) e o CM4 pela avaliação da capacitação espermática (estabilidade e fluidez das membranas - 3 SE) durante o processo de criopreservação de sêmen ovino suplementado com os antioxidantes Trolox e Catalase e determinar o melhor método de separação e recuperação espermática de sêmen ovino criopreservado através das subpopulações para a utilização em biotecnologias da reprodução assistida. No Experimento 1, serão determinadas SE durante o processo de criopreservação de sêmen ovino suplementado com os antioxidantes Trolox e Catalase, utilizando-se três ejaculados de cada carneiro da raça Dorper (n=10), colhidos por meio de vagina artificial. Serão realizadas nos momentos pós-coleta (M1), pós-refrigeração (M2) e pós-descongelação (M3), as avaliações pela CASA (CM1), e por citometria de fluxo para integridade total das membranas espermáticas pela combinação dos fluorocromos iodeto de propídio (IP) e aglutinina de pisum sativum conjugada ao isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA), a apoptose pela Anexina-V e a capacitação espermática pela combinação dos fluocromos merocianina-540 (M540) e Yo-Pro 1 (CM2, CM3 e CM4, respectivamente) e a lipoperoxidação será avaliada pela técnica dos TBARS. No Experimento 2, será realizado a separação e recuperação espermática pelos métodos de swim-up/dextran e pelo gradiente de Percoll com densidades 70% e 35% suplementados com os antioxidantes Trolox ou Catalase de sêmen ovino criopreservado provenientes do Exp.1 e de centros processadores de material genético, classificando conforme as SE determinadas pelo Exp.1. As avaliações pela CASA e citometria de fluxo serão idem ao Exp. 1 (AU)

Proposta de critérios para o estabelecimento do perfil das subpopulações espermáticas como padrão qualitativo em sêmen ovino criopreservado visando a reprodução assistida

Beneficiário:Leandro Rodello
Instituição: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Sony Dimas Bicudo
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Processo:11/12548-5
Vigência: 01 de setembro de 2011 - 31 de agosto de 2013
Resumo
Objetiva-se determinar as subpopulações espermáticas (SE) através de quatro critérios metodológicos (CM) envolvendo o CM1 pela análise computadorizada da cinética espermática (CASA - 5 SE), o CM2 pela avaliação da integridade da membrana plasmática e a reação acrossomal (4 SE), o CM3 pela quantificação de apoptose espermática (4 SE) e o CM4 pela avaliação da capacitação espermática (estabilidade e fluidez das membranas - 3 SE) durante o processo de criopreservação de sêmen ovino suplementado com os antioxidantes Trolox e Catalase e determinar o melhor método de separação e recuperação espermática de sêmen ovino criopreservado através das subpopulações para a utilização em biotecnologias da reprodução assistida. No Experimento 1, serão determinadas SE durante o processo de criopreservação de sêmen ovino suplementado com os antioxidantes Trolox e Catalase, utilizando-se três ejaculados de cada carneiro da raça Dorper (n=10), colhidos por meio de vagina artificial. Serão realizadas nos momentos pós-coleta (M1), pós-refrigeração (M2) e pós-descongelação (M3), as avaliações pela CASA (CM1), e por citometria de fluxo para integridade total das membranas espermáticas pela combinação dos fluorocromos iodeto de propídio (IP) e aglutinina de pisum sativum conjugada ao isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA), a apoptose pela Anexina-V e a capacitação espermática pela combinação dos fluocromos merocianina-540 (M540) e Yo-Pro 1 (CM2, CM3 e CM4, respectivamente) e a lipoperoxidação será avaliada pela técnica dos TBARS. No Experimento 2, será realizado a separação e recuperação espermática pelos métodos de swim-up/dextran e pelo gradiente de Percoll com densidades 70% e 35% suplementados com os antioxidantes Trolox ou Catalase de sêmen ovino criopreservado provenientes do Exp.1 e de centros processadores de material genético, classificando conforme as SE determinadas pelo Exp.1. As avaliações pela CASA e citometria de fluxo serão idem ao Exp. 1 (AU)

Suplementação com gordura e/ou substâncias antioxidantes, ou sexagem por citometria de fluxo e seus efeitos na viabilidade espermática em bovinos

Beneficiário:Roberto Sartori Filho
Instituição: Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ). Universidade de São Paulo (USP). Piracicaba, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Roberto Sartori Filho
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:10/15054-0
Vigência: 01 de janeiro de 2011 - 31 de dezembro de 2012
Assunto(s):MorfometriaSêmen
Resumo
Esta proposta refere-se a dois estudos independentes relacionados a fatores (nutrição e sexagem espermática) que interferem na viabilidade do sêmen bovino. A criopreservação de sêmen é de fundamental importância para a expansão das técnicas reprodutivas como a IA, TE e FIV, entretanto pode levar a estresse oxidativo da célula espermática. Deste modo, esta deve possuir membrana plasmática com adequada fluidez que é garantida, entre outros fatores, pelos ácidos graxos poli-insaturados e suporte de defesa antioxidante para incrementar a sobrevivência celular após a congelação. No intuito de tornar espermatozóides mais resistentes à criopreservação, no estudo envolvendo aspectos nutricionais, 40 touros das raças Canchim e Nelore serão suplementados com gordura protegida e/ou vitamina C e selênio durante 70 dias. Neste período, colheitas e congelação de sêmen serão realizadas com intervalo de 14 dias. No sêmen fresco e após congelação/descongelação, serão realizadas diversas avaliações, tais como: vigor, turbilhonamento, concentração e motilidades progressiva e total, além de outros exames complementares: aglutinação de cabeça em contraste de fase, integridade de membrana plasmática com iodeto de propídeo e diacetato 6-carboxifluoresceína (C-FDA), integridade de acrossoma (Peannut aglutinin-PNA e iodeto de propídeo), capacitação espermática com hidroclorido de clortetraciclina (CTC), integridade de cromatina e morfometria espermática com azul de toluidina por meio de análise computadorizada. Além disso, sangue será colhido para posterior dosagem de testosterona, concentração de selênio e atividade da enzima glutationa peroxidase. O objetivo do estudo com sêmen sexado é comparar diferentes características espermáticas entre sêmen sexado e não sexado e embriões produzidos com sêmen de ambos os grupos. Para isto, um ejaculado de cada touro (n=4) da raça Nelore, será colhido e fracionado em três partes: não sexado (NS), sexado contendo cromossomo X (SX) ou cromossomo Y (SY). Para avaliação morfométrica da cabeça do SX vs. SY e pool de SX e SY vs. NS serão feitas 100 imagens de células por amostra de todos os touros/tratamento por meio de microscopia de força atômica. As imagens serão avaliadas em software SPM Off-line quanto às medidas uni, bi e tridimensionais e quanto aos descritores de forma, totalizando 28 variáveis. Padrão de metilação do DNA será avaliado na região diferencialmente metilada (DMR) do gene IGF2 e IGF2R. Todo o procedimento será repetido três vezes. Embriões produzidos in vitro com este sêmen dos três tratamentos serão utilizados para avaliação do padrão de metilação e expressão gênica. Quatro pools de 12 embriões de cada grupo serão formados para avaliação da expressão de diversos genes, tais como, PLAC-8, KRT-8, Interferon-tau, MnSOD, Hsp-70, DNMT 3A, DNMT 3B, DNMT 1, Glucose Transporter (GLUT) 1, 2 e 3 por PCR em tempo real. Do mesmo material será extraído DNA genômico para avaliação do padrão de metilação da DMR do gene IGF2 e IGF2R. Além disto, será realizada a comparação entre os grupos quanto à capacidade de ligação dos espermatozóides sexados e não sexados com as células da tuba uterina, também realizada em três diferentes repetições. O tempo de viabilidade do espermatozóide SX, SY e NS em meio de fecundação também será avaliado. (AU)
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