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Prospecção de atividade de lipídios e carreadores lipídicos em soluções crioprotetoras e desenvolvimento de kits para uso em tecnologia da reprodução assistida

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: INVITRA - Tecnologia da Reprodução Assistida Ltda
Pesquisador responsável:Alessandra Aparecida Vireque
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
Processo:14/26820-7
Vigência: 01 de fevereiro de 2015 - 30 de junho de 2015
Assunto(s):NanotecnologiaBiotecnologia da reproduçãoTécnicas reprodutivas assistidasCriopreservação
Resumo
A técnica de vitrificação de oócitos é de fácil execução, porém resultados satisfatórios exigem conhecimento teórico-prático e habilidade com os procedimentos. São etapas críticas o preparo dos meios crioprotetores e a execução das etapas de vitrificação e desvitrificação dos oócitos dentro dos tempos preconizados no protocolo experimental. As técnicas de produção in vitro de embriões são complexas e requerem um alto nível de organização da rotina laboratorial, desde o adequado preparo de material para a pesquisa e meios de cultura, envolvendo um rigoroso controle de qualidade, até a habilidade para a execução dos procedimentos de maturação, fertilização in vitro, capacitação espermática e cultivo embrionário. O bolsista designado para esta atividade deve apresentar conhecimento teórico e habilidade com as técnicas descritas, bem como perfil para a pesquisa científica e interface com outras áreas do conhecimento como a Química e Física.Objetivos1-Realizar os procedimentos de aspiração folicular de ovários bovinos;2-Realizar a técnica de maturação in vitro de oócitos bovinos e procedimentos correlatos;3-Executar a técnica de vitrificação de oócitos bovinos e os procedimentos de desvitrificação, análise morfológica (teste de sobrevivência) e preparo de oócitos para a fecundação in vitro (FIV);4-Executar as técnicas de produção in vitro de embriões;5-Responsabilizar-se por todos os procedimentos laboratoriais e checagem de materiais necessários para a criopreservação e produção in vitro de embriões; 6-Registrar os dados referentes aos experimentos em planilhas específicas.7-Preparar as soluções necessárias para a fixação e transporte de oócitos para análise de perfil lipídico;8-Preparar oócitos para a realização da técnica de espectrometria de massas (MALDI-MS) (AU)

Efeito do sistema de refrigeração na criopreservação de sêmen bovino

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: Instituto de Zootecnia. Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA). Secretaria de Agricultura e Abastecimento (São Paulo - Estado). Nova Odessa, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Fabio Morato Monteiro
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:14/11304-3
Vigência: 01 de outubro de 2014 - 30 de setembro de 2016
Assunto(s):Andrologia veterináriaCriopreservação animalSêmen animalCapacitação espermáticaBovinosGado Nelore
Resumo
Umas das principais etapas no processo de criopreservação do sêmen é a curva de refrigeração. O ritmo de refrigeração pode diminuir o choque térmico e seus danos as células espermáticas, com isso melhores resultados na criopreservação poderiam ser melhorados utilizando-se curvas de refrigeração mais lentas e homogêneas, mas em alguns sistemas de refrigeração, como refrigeradores domésticos, isso não acontece. Com isso, o objetivo do trabalho é confrontar simultaneamente diferentes sistemas de refrigeração e criopreservação de sêmen bovino, e seus efeitos na qualidade do sêmen criopreservado. O delineamento experimental utilizado será inteiramente casualizado, em esquema fatorial 5x2, com 5 sistemas de refrigeração e 2 sistemas de criopreservação de sêmen, totalizando 10 tratamentos. Serão utilizados 2 ejaculados de 15 touros da raça Nelore, totalizando 30 ejaculados, sendo colhidos por meio de eletroejaculador. Os ejaculados serão diluídos em meio de fração única (BotuBov®) para concentração final de 60x106 spz/ml, após a diluição serão refrigerados por 5 horas em 5 sistemas diferentes de refrigeração (TK 4000® com curva de resfriamento de 0,25ºC/minuto; TK 4000® com curva de resfriamento de 0,5ºC/minuto, refrigerador Minitüb® 518C, BotuTainer® e refrigerador doméstico comum) e 2 de criopreservação (TK 4000® e isopor com nitrogênio líquido). A cinética espermática será realizada pelo aparelho IVOS (Versão 14, Hamilton-Thorne Bioscience) em três momentos: após 5 horas de refrigeração (antes da criopreservação), após a criopreservação e após o teste de termoresistencia rápida (TTR). Além disso, será realizada a avaliação da integridade de membrana plasmática, acrossomal e mitocondrial utilizando associação de sondas fluorescentes. As análises dos dados gerados ajudarão a elucidar qual melhor sistema de refrigeração e criopreservação que poderá beneficiar os técnicos que atuam no campo. (AU)

Exposição pré-puberal a baixas doses de metilmercúrio e aroclor associados: avaliação de parâmetros reprodutivos e endócrinos de ratos púberes e adultos

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: Instituto de Saúde e Sociedade (ISS). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus Baixada Santista. Santos, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Juliana Elaine Perobelli
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Morfologia - Histologia
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:13/14477-3
Vigência: 01 de outubro de 2013 - 30 de setembro de 2015
Assunto(s):Toxicologia reprodutivaCapacitação espermáticaCompostos de metilmercúrioBisfenol policloradoPuberdade
Resumo
O metilmercúrio (MeHg) e os bisfenois policlorinados (PCBs) são agentes tóxicos persistentes no ambiente e que sofrem biomagnificação ao longo da cadeia trófica. A principal fonte de exposição da população a estes compostos se dá através do consumo de peixes e frutos do mar contaminados. Muitos estudos epidemiológicos e experimentais tem mostrado que isoladamente estes químicos são neurotóxicos e podem causar efeitos adversos sobre parâmetros reprodutivos e sistema endócrino. No entanto, observa-se uma escassez de estudos que investiguem aspectos reprodutivos e endócrinos após exposição ao MeHg e PCBs associados, principalmente em modelos de exposição durante a pré e peri-puberdade. A exposição durante a infância/pré-puberdade merece atenção especial, pois nesta fase o indivíduo está pela primeira vez em contato direto com os contaminantes ambientais, sem o intermédio do metabolismo materno como acontece durante a gestação e lactação. Frente a isso, o presente estudo propõe investigar se a exposição ao MeHg e Aroclor (mistura comercial de PCBs) associados e em baixas doses durante a fase pré-puberal interfere em parâmetros reprodutivos e endócrinos do rato macho. Serão analisados os testículos, epidídimos e tireoide de ratos machos na puberdade (avaliação imediata) e na idade adulta (avaliação tardia), após 62 dias sem exposição aos químicos. Com os resultados do presente estudo espera-se obter informações mais esclarecedoras sobre as consequências da exposição pré-puberal ao MeHg e Aroclor associados, com foco sobre a saúde reprodutiva, endócrina e qualidade espermática dos animais. (AU)

Avaliação das subpopulações espermáticas no ejaculado de cães, visando a análise de fertilidade e criopreservação

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Maria Denise Lopes
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Processo:13/02050-5
Vigência: 01 de junho de 2013 - 29 de fevereiro de 2016
Assunto(s):CriopreservaçãoSêmen animalFertilidadeCães
Resumo
Este estudo tem como objetivo identificar animais de maior e menor fertilidade e testar seu comportamento frente aos procedimentos de criopreservação através da análise de agrupamentos das subpopulações espermáticas (SE) e de fertilidade. O sêmen será avaliado para a determinação e avaliação de SE através da análise computadorizada da cinética espermática (CASA), da integridade da membrana plasmática, da quantificação de apoptose espermática e pela avaliação da capacitação espermática e reação acrossomal, durante o processo de criopreservação. Serão realizados dois experimentos: no Experimento 1, serão determinadas as SE, durante o processo de criopreservação do sêmen de 5 cães, utilizando quatro ejaculados de cada animal; as análises serão realizadas nos momentos de pós-coleta, pós-refrigeração e pós-descongelação. As avaliações da cinética espermática serão realizadas pelo CASA e a integridade das membranas espermáticas por citometria de fluxo usando uma combinação dos fluorocromos: iodeto de propídio (IP) e aglutinina de Pisum sativum conjugada ao isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA). A apoptose será avaliada pela Anexina-V e a capacitação espermática pela combinação dos fluocromos merocianina-540 (M540) e Yo-Pro 1. Com a análise dos resultados os machos serão separados como os de maior e menor fertilidade (HIF e LOF). Dentre os 5 cães serão escolhidos um (1) HIF e um (1) LOF serão utilizados no Experimento 2. No Experimento 2, as subpopulações de maior potencial fertilizante serão identificadas nos dois cães selecionados no experimento I e avaliadas in vivo por meio da Inseminação Artificial. Para isso o método de separação espermática a ser utilizado será o Gradiente PureSperm® com densidades de 80 e 40 (DOURADO et al. 2011). A inseminação artificial será realizada em um grupo de 20 cadelas para comparação quanto aos resultados de fertilização entre os cães de maior fertilidade (HIFS, n = 10) e o de menor fertilidade (LOFS, n = 10). A inseminação artificial transcervical será realizada com o auxílio de endoscópio rígido para visualização do anel cervical e cateterização. Decorridos 10/12 dias após a ovulação a ováriosalpingohisterectomia (OSH) destas cadelas será feita para a identificação, contagem e avaliação dos embriões. (AU)

Efeito do estresse oxidativo no espermatozóide e relação com o desenvolvimento embrionário

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Mayra Elena Ortiz D' Avila Assumpcao
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Processo:12/22915-8
Vigência: 01 de abril de 2013 - 30 de novembro de 2014
Assunto(s):EmbriogêneseEstresse oxidativoBiotecnologia da reproduçãoBovinos
Resumo
Tendo em vista a importância do espermatozoide no momento da fecundação e o desenvolvimento embrionário inicial, conhecer o efeito de alterações decorrentes da criopreservação, como a produção das espécies reativas de oxigênio (EROs) e respectivos efeitos nesta célula é fundamental para o aprimoramento de biotécnicas como a produção in vitro de embriões (PIV). Este estudo tem como objetivos avaliar o impacto de diferentes concentrações de agentes indutores de estresse oxidativo sobre o espermatozoide e o efeito deste estresse oxidativo nos estágios iniciais do desenvolvimento de embriões PIV. Em uma primeira fase, espermatozoides tratados e controle serão corados com sondas fluorescentes e avaliados por citometria de fluxo capilar. Variáveis espermáticas relacionadas à estrutura da cromatina (laranja de acridina), potencial mitocondrial (JC-1), integridade de membranas (FITC-PI) e capacitação espermática (clortetraticlina), além dos relacionados ao estresse oxidativo (diacetato de diclorfluoresceína, CellROX®, e C11-BODIPY) serão analisadas nesta fase. Além da citometria de fluxo microcapilar, parte do sedimento será separada para realização do ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs). Em uma segunda fase, os grupos de espermatozoides tratados com agentes indutores de estresse oxidativo e controle serão utilizados na produção in vitro de embriões buscando verificar o impacto de diferentes níveis de estresse oxidativo na fecundação in vitro e no desenvolvimento inicial do embrião. Para isto, os embriões serão avaliados com relação à velocidade de clivagem e formação de pró-núcleo. (AU)

Análise da capacidade de ligação de células espermáticas provenientes do epidídimo às células do oviduto cultivadas in vitro na espécie equina

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:José Antonio Dell Aqua Junior
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:12/17320-5
Vigência: 01 de novembro de 2012 - 31 de outubro de 2014
Assunto(s):Biotecnologia da reproduçãoEspermatozoides animalProteínas secretadas pelo epidídimoCapacitação espermáticaFertilização in vitro animalEquinos
Resumo
Muitas biotecnologias estão sendo desenvolvidas visando a conservação do material genético de garanhões de alto valor zootécnico, dentre elas podemos destacar a colheita de espermatozóides do epidídimo de animais que sofreram algum trauma ou enfermidade que impossibilitem a colheita do sêmen, óbito ou eutanásia. Porém essas células espermáticas não entram em contato com o plasma seminal, importante por conter proteínas que participam de processos relacionados à proteção e fixação dos espermatozóides nos sítios de ligação dos reservatórios espermáticos na tuba uterina. A colonização dos reservatórios espermáticos no oviduto é um importante fenômeno responsável pela redução do risco de poliespermia por liberar uma quantidade pequena e suficiente de espermatozóides para a fecundação no momento da ovulação e previne a capacitação espermática precoce mantendo em nível basal a concentração intracelular de cálcio. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a capacidade de ligação de células espermáticas provenientes da cauda do epidídimo às células do oviduto cultivadas in vitro na espécie equina. Para isso, serão comparados os parâmetros espermáticos entre espermatozóides in natura e congelados obtidos do ejaculado e da cauda do epidídimo de dez garanhões, os quais serão incubados com células do istimo de éguas cultivadas in vitro. Após o período de incubação, os explantes serão retirados das gotas com o mínimo possível de meio, o volume restante das gotas será aspirado e a concentração de espermatozoides remanescentes será contada. O número de espermatozoides que se ligou será estimado pela subtração do número de espermatozoides após o período de incubação da concentração inicial de espermatozoides. (AU)

Análise da capacidade de ligação de células espermáticas provenientes do epidídimo às células do oviduto cultivadas in vitro na espécie equina

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:José Antonio Dell Aqua Junior
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Processo:12/12526-4
Vigência: 01 de outubro de 2012 - 30 de junho de 2014
Resumo
Muitas biotecnologias estão sendo desenvolvidas visando a conservação do material genético de garanhões de alto valor zootécnico, dentre elas podemos destacar a colheita de espermatozóides do epidídimo de animais que sofreram algum trauma ou enfermidade que impossibilitem a colheita do sêmen, óbito ou eutanásia. Porém essas células espermáticas não entram em contato com o plasma seminal, importante por conter proteínas que participam de processos relacionados à proteção e fixação dos espermatozóides nos sítios de ligação dos reservatórios espermáticos na tuba uterina. A colonização dos reservatórios espermáticos no oviduto é um importante fenômeno responsável pela redução do risco de poliespermia por liberar uma quantidade pequena e suficiente de espermatozóides para a fecundação no momento da ovulação e previne a capacitação espermática precoce mantendo em nível basal a concentração intracelular de cálcio. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a capacidade de ligação de células espermáticas provenientes da cauda do epidídimo às células do oviduto cultivadas in vitro na espécie equina. Para isso, serão comparados os parâmetros espermáticos entre espermatozóides congelados obitidos do ejaculado e da cauda do epidídimo de dez garanhões, os quais serão incubados com células do istimo de éguas cultivadas in vitro. Após o período de incubação, os explantes serão retirados das gotas com o mínimo possível de meio, o volume restante das gotas será aspirado e a concentração de espermatozoides remanescentes será contada. O número de espermatozoides que se ligou será estimado pela subtração do número de espermatozoides após o período de incubação da concentração inicial de espermatozoides. (AU)

Avaliação dos constituintes protéicos do plasma seminal e sua correlação com a fertilidade de garanhões

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Frederico Ozanam Papa
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:11/17625-8
Vigência: 01 de março de 2012 - 31 de agosto de 2014
Assunto(s):Sêmen animalCitometria de fluxoEquinos
Resumo
A espécie equina possui reduzidos índices de fertilidade quando comparada com as demais espécies domésticas. Parte dessas observações relaciona-se ao fato de que na equinocultura, não é realizada a seleção dos animais pela fertilidade. Além disso, há tendências de se atribuir à fêmea os problemas de infertilidade, o que compromete uma avaliação mais criteriosa envolvendo o macho. Dentre os fatores que podem alterar os índices reprodutivos, a qualidade seminal assume um efeito considerável. Já foi demonstrado que alguns componentes do plasma seminal estão relacionados com a fertilidade do sêmen bovino, sugerindo que a determinação destes componentes poderia ser considerada uma forma de avaliação do ejaculado. Desta forma, serão comparados parâmetros de cinética espermática, integridade de membrana plasmática e acrossomal, peroxidação lipídica, integridade de DNA, capacitação espermática, valor absoluto do potencial de membrana plasmática e a verificação e quantificação da presença das proteínas semenogelina e osteopontina nos espermatozóides de garanhões férteis e subférteis. Além disso, com o objetivo de identificar as proteínas do plasma seminal de garanhões férteis e subférteis que supostamente estariam correlacionadas com a fertilidade, será realizada a técnica de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa. O isolamento e caracterização das proteínas presentes no plasma seminal podem possibilitar a avaliação de sua influência sobre as células espermáticas e a identificação segura e precoce de garanhões férteis em relação àqueles subférteis. E do mesmo modo, possibilitar o desenvolvimento de novas técnicas que contribuam para o aumento e predição da fertilidade em garanhões. (AU)

"SPAG11C e GLRX3 no trato reprodutor masculino de ratos: interação proteína/proteína, expressão celular e papel fisiológico"

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: Instituto Nacional de Farmacologia (INFAR). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). São Paulo, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Maria Christina Werneck de Avellar
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Geral
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Processo:11/16290-2
Vigência: 01 de março de 2012 - 31 de outubro de 2013
Assunto(s):ProteômicaEpididimoExpressão gênica
Resumo
SPAG11 (sperm associated antigen 11) constitui uma família de proteínas que apresentam um domínio específico designado "Sperm antigen HE2" e algumas isoformas apresentam também um domínio de ²-defensinas. Essas proteínas são abundantemente expressas no trato reprodutor masculino, em especial no epidídimo. SPAG11 apresenta atividade antimicrobiana in vitro, além de estar envolvida na maturação e capacitação espermática, sobrevivência do espermatozóide e interação espermatozóide-oócito. Apesar de todas essas funções, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação e função biológica. Através de ensaios de duplo híbrido, detectamos a interação da isoforma SPAG11C com a proteína glutaredoxin 3 (GLRX3). GLRX3 é expressa em vários tecidos, bem como no trato reprodutor. Sua interação já foi descrita com outras proteínas, entre as quais, a MLP (muscle LIM protein), uma proteína abundantemente expressa em músculo e que até o momento teve sua função relacionada com a hipertrofia cardíaca. GLRX3 exerce um efeito indireto na ativação de calcineurina via sua interação com MLP, o que resulta em regressão do processo de hipertrofia induzida do músculo cardíaco. Ainda não dispomos de nenhuma informação sobre o possível papel de SPAG11C em tecidos musculares. Assim, o presente projeto tem como objetivo estudar a interação entre SPAG11C e GLRX3 in vitro, avaliar a expressão no trato reprodutor masculino e em tecidos não reprodutivos de ratos e investigar a possível função celular do complexo SPAG11C/GLRX3 em cultura de cardiomiócitos neonatais, que poderá em uma segunda etapa, ser avaliado em células do trato reprodutor. (AU)

Proposta de critérios para o estabelecimento do perfil das subpopulações espermáticas como padrão qualitativo em sêmen ovino criopreservado visando a reprodução assistida

Beneficiário:
Instituição-sede da pesquisa: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Botucatu. Botucatu, SP, Brasil
Pesquisador responsável:Sony Dimas Bicudo
Área do conhecimento:Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Reprodução Animal
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Processo:11/19081-5
Vigência: 01 de fevereiro de 2012 - 31 de julho de 2014
Assunto(s):Citometria de fluxoSêmen animalCriopreservação animalAntioxidantesOvinos
Resumo
Objetiva-se determinar as subpopulações espermáticas (SE) através de quatro critérios metodológicos (CM) envolvendo o CM1 pela análise computadorizada da cinética espermática (CASA - 5 SE), o CM2 pela avaliação da integridade da membrana plasmática e a reação acrossomal (4 SE), o CM3 pela quantificação de apoptose espermática (4 SE) e o CM4 pela avaliação da capacitação espermática (estabilidade e fluidez das membranas - 3 SE) durante o processo de criopreservação de sêmen ovino suplementado com os antioxidantes Trolox e Catalase e determinar o melhor método de separação e recuperação espermática de sêmen ovino criopreservado através das subpopulações para a utilização em biotecnologias da reprodução assistida. No Experimento 1, serão determinadas SE durante o processo de criopreservação de sêmen ovino suplementado com os antioxidantes Trolox e Catalase, utilizando-se três ejaculados de cada carneiro da raça Dorper (n=10), colhidos por meio de vagina artificial. Serão realizadas nos momentos pós-coleta (M1), pós-refrigeração (M2) e pós-descongelação (M3), as avaliações pela CASA (CM1), e por citometria de fluxo para integridade total das membranas espermáticas pela combinação dos fluorocromos iodeto de propídio (IP) e aglutinina de pisum sativum conjugada ao isotiocionato de fluoresceína (FITC-PSA), a apoptose pela Anexina-V e a capacitação espermática pela combinação dos fluocromos merocianina-540 (M540) e Yo-Pro 1 (CM2, CM3 e CM4, respectivamente) e a lipoperoxidação será avaliada pela técnica dos TBARS. No Experimento 2, será realizado a separação e recuperação espermática pelos métodos de swim-up/dextran e pelo gradiente de Percoll com densidades 70% e 35% suplementados com os antioxidantes Trolox ou Catalase de sêmen ovino criopreservado provenientes do Exp.1 e de centros processadores de material genético, classificando conforme as SE determinadas pelo Exp.1. As avaliações pela CASA e citometria de fluxo serão idem ao Exp. 1 (AU)
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