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Resumo

A criopreservação espermática é considerada um processo-chave para a utilização das biotecnologias reprodutivas, tais como a inseminação artificial e a fertilização in vitro. No entanto, sabe-se que esta técnica causa diminuição na qualidade espermática. Dentre os fatores envolvidos (e.g., formação de cristais de gelo, aumento da osmolaridade) um mecanismo agravante envolvido direta ou indiretamente nos danos durante a criopreservação seria o estresse oxidativo. Uma vez que a mitocôndria representa a principal fonte liberadora de agentes pró-oxidantes, acredita-se que esta organela possui um papel central no desequilíbrio oxidativo do espermatozoide. Portanto, disfunções mitocondriais durante a criopreservação espermática, especialmente relacionadas à danos intracelulares em organelas, são, possivelmente, a origem da liberação excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs). Este quadro caracterizaria o estresse oxidativo, que pode constituir uma importante fonte de danos aos espermatozoides pós-descongelação. Além disso, foi verificada uma redução na capacidade antioxidante dos espermatozoides após a criopreservação, predispondo ainda mais estas células ao estresse oxidativo.Desta forma, diversos estudos vêm sendo conduzidos visando desenvolver terapias antioxidantes para amostras espermáticas submetidas à criopreservação, objetivando a prevenção do desbalanço oxidativo. No entanto, para que uma terapia antioxidante seja eficiente é necessária uma concentração ideal destes antioxidantes para manter um equilíbrio de oxirredução, já que as EROs possuem um papel fisiológico nos processos de capacitação espermática e fecundação. Além disso, cada antioxidante atua eliminando preferencialmente uma ERO específica. Adicionalmente, cada estrutura espermática pode ser mais susceptível à uma determinada ERO. Portanto, para estes tratamentos serem efetivos o ideal seria realizar uma terapia composta por uma associação entre estes antioxidantes com concentrações precisas e específicas, o que pode tornar este tratamento inviável. Baseando-se nestas assertivas, a utilização de um protetor mitocondrial específico durante a criopreservação poderia melhorar a qualidade espermática pós-criopreservação. Tal abordagem seria interessante uma vez que diminuiria o estresse oxidativo ao evitar a formação excessiva de EROs e não o combate aos radicais livres já formados. Neste contexto, uma possível alternativa seria um leve desacoplamento mitocondrial durante o processo de criopreservação espermática, para que possíveis efeitos deletérios de disfunções mitocondriais sejam amenizados pela menor liberação de espécies reativas de oxigênio. De fato, a atividade de alguns desacopladores foram identificadas em processos fisiológicos de células somáticas, atuando na prevenção do estresse oxidativo.O efeito protetor dos desacopladores mitocondriais durante a criopreservação espermática foi verificado em espermatozoides de peixes e primatas. No entanto, há uma necessidade de estudos mais detalhados para verificar o papel desta molécula no metabolismo espermático e na homeostase oxidativa. Neste contexto, estudos envolvendo espermatozoides bovinos seriam de extrema importância uma vez que esta espécie é amplamente utilizada em biotecnologias reprodutivas, de extrema importância para o incremento na produção de proteína de alta qualidade e no aumento da produtividade da pecuária nacional.Portanto, o objetivo deste estudo será promover um moderado desacoplamento mitocondrial dos espermatozoides bovinos durante o processo de criopreservação espermática e verificar o efeito desta terapia na funcionalidade espermática, bioenergética e homeostase oxidativa, objetivando uma melhoria tanto na qualidade dos espermatozoides bovinos pós-descongelação quanto nos processos de fecundação in vitro e de desenvolvimento embrionário. (AU)

Resumo

É disseminado na reprodução da espécie equina o uso de sêmen refrigerado, devido a boa aceitabilidade dos criadores diante da fertilidade satisfatória. Por outro lado, o sêmen criopreservado ainda possui barreiras a serem ultrapassadas, uma vez que nem todos os animais possuem um sêmen resistente ao estresse causado pelo processo. Assim, estudos são realizados visando a obtenção de um produto de melhor qualidade, minimizando os efeitos deletérios que a criopreservação causa à célula espermática. Foi demonstrado que o uso de plasma seminal no congelamento do sêmen promove a ocorrência destes efeitos, de modo que, atualmente, preconiza-se a retirada deste composto. Na monta natural, contudo, o plasma seminal possui um papel fundamental para a manutenção dos espermatozoides no trato da fêmea, capacitação espermática, modulação da inflamação uterina e ação antioxidante. Diante destas características avalia-se a possibilidade de benefícios associados à sua utilização na criopreservação. No presente estudo, portanto, pretende-se analisar a qualidade do sêmen após adição de 20% do plasma seminal antes do processo de congelação, comparando-o com as características na descongelação do mesmo sem a adição do composto. Além disso, serão avaliadas as ações dos plasmas seminais autólogo e homólogo adicionados após o processo de congelamento, objetivando visualizar a repercussão da adição dos diferentes plasmas seminais na qualidade do sêmen na pré e pós criopreservação. (AU)

Resumo

Os ovidutos promovem um microambiente adequado para a maturação oocitária, reserva e capacitação espermática, fertilização, transporte dos gametas e desenvolvimento inicial do embrião. Devido às limitações práticas de manejo animal e alto custo de estudos in vivo, sistemas de cultivo de células do oviduto são modelos adequados e convenientes para estudo in vitro, tais como os sistemas polarizados (3D). O cultivo 3D garante a manutenção da polaridade celular, desenvolvimento do epitélio ciliar e viabilidade celular por um tempo maior, mostrando ser um promissor modelo para pesquisa e aplicação. O controle funcional do oviduto é multifatorial e estudos mostram alteração transcricional, proteica e funcional do oviduto durante o ciclo estral, entre os antímeros de ovulação em animais monovulatórios, quanto à presença dos gametas e embrião, número de embriões presentes e concentração plasmática de progesterona (alta e baixa concentração, correlacionada ao tamanho do corpo lúteo ovariano). Nessa mesma vertente, trabalhos do nosso grupo de pesquisa já demonstraram efeitos de protocolo de superestimulação ovariana na regulação de transcritos no oviduto bovino relacionados com a contratilidade do oviduto e interação gamética. Tais alterações apresentaram positiva correlação com a concentração plasmática elevada de estradiol nas vacas submetidas ao protocolo de superestimulação. Como a produção e liberação de estradiol folicular parecem estar envolvidas no controle da secreção celular, frequência dos batimentos ciliares epiteliais e contração da musculatura lisa; e o aumento de estradiol correlaciona-se positivamente com expressão de fatores ovidutais, o presente projeto objetiva investigar o perfil transcricional de Células Epiteliais do Oviduto Bovino (CEOB) sob duas condições de cultivo: baixa concentração de estradiol (Grupo Baixo, E2“) e alta concentração de estradiol (Grupo Alto, E2‘; EXPERIMENTO I). Para isso, um cultivo 3D de CEOB será submetido a dois tratamentos com estradiol: doses 300 e 750 pg/mL (o desenvolvimento desse experimento vincula-se a um estágio no exterior junto ao grupo de pesquisa do Prof. Dr. Bart Gadella da Universiteit Utrecht, Utrecht, Holand, bolsa BEPE, FAPESP, para ganho de Know-how do cultivo 3D de CEOB). Além da avaliação das células do oviduto, o meio sobrenadante será coletado e processado para isolamento dos exossomos (EXOs), objetivando caracterizar o perfil proteico desses EXOs (EXPERIMENTO II), bem como, verificar os efeitos da adição desses EXOs no cultivo in vitro da produção in vitro de embriões bovino sobre a eficiência de produção embrionária e impacto sobre a qualidade dos blastocistos (EXPERIMENTO III). A conciliação das informações providas pelo perfil de transcritos das CEOB, perfil proteico de EXOs produzidos pelo cultivo e efeito desses EXOs adicionados na produção embrionária sob condições de alta ou baixa concentração de estradiol prospecta possibilidade de compreensão do efeito direto e função do estradiol no controle do oviduto bovino, quiçá sendo uma estratégia para impactar a produção in vitro de embriões bovino. (AU)

Resumo

A infertilidade masculina vem crescendo expressivamente na população. A varicocele é a causa mais comum de infertilidade passível de correção. Seu aparecimento coincide com o início da puberdade e interfere no desenvolvimento testicular. Embora os mecanismos que levam à redução da fertilidade em homens com varicocele sejam incertos, sabe-se que, neste distúrbio, ocorre um aumento na temperatura testicular, conduzindo à hipóxia e culminando com o aumento do estresse oxidativo. Os radicais livres gerados danificam a membrana celular e o DNA do espermatozoide, afetando sua viabilidade, capacitação e reação acrossômica. Antioxidantes podem proteger o corpo humano contra os efeitos causados pelo estresse oxidativo, retardando o progresso de muitas doenças e, por este motivo, eles vêm sendo estudados como uma alternativa terapêutica, ou como tratamento adjuvante, na prevenção e no reparo da infertilidade masculina. O objetivo do presente estudo é investigar o papel do resveratrol (fitoalexina com propriedade antioxidante, encontrada em diversos tipos de plantas) sobre parâmetros reprodutivos e o estresse oxidativo de ratos adultos (linhagem Wistar) apresentando varicocele causada experimentalmente a partir da peripuberdade. A varicocele esquerda será induzida cirurgicamente aos 41 dpp, através da ligadura parcial na veia renal esquerda nos animais dos grupos varicocele (V, n=82) e varicocele tratado com resveratrol (VR, n=82). O grupo controle Sham (S, n=46) será submetido a procedimento cirúrgico similar, porém sem a ligadura parcial da veia renal, e será tratado com carboximetilcelulose (veículo do resveratrol). Os grupos resveratrol (R, n=46) e VR receberão diariamente 300mg/Kg de peso corpóreo de resveratrol (gavagem). Aos 100dpp os animais serão submetidos à eutanásia e os testículos serão coletados para avaliação da produção diária de espermatozoides, do estresse oxidativo e de marcadores de vias apoptóticas (proteínas Bax e Bcl-2, pela técnica de Western Blot). Dosagens plasmáticas e intratesticulares de testosterona serão também avaliadas. Os epidídimos serão coletados para avaliação da concentração de espermatozoides, do tempo de trânsito espermático, do estresse oxidativo (usando técnicas para detecção de hidroperóxidos, malondialdeído e enzimas antioxidantes) e para realização de análises histopatológica, morfométrica, estereológica e da marcação imunoenzimática de apoptose (método TUNEL). A mensuração de hidroperóxidos será também realizada nos testículos; todas as análises serão realizadas nos testículos e epidídimos ipsilaterais e contralaterais à lesão pela varicocele. Os espermatozoides colhidos da cauda dos epidídimos esquerdo e direito serão respectivamente avaliados quanto à estrutura da cromatina (Ensaio da laranja de acridina, em citômetro de fluxo), ao nível de protaminação (método CMA3, em citômetro de fluxo), à integridade do acrossoma e à capacitação (utilizando a clortetraciclina em microscopia de epifluorescência), à função mitocondrial (sonda MitoTracker Green FM em microscopia de epifluorescência), à atividade mitocondrial (Ensaio Cytochrome c Oxidase pelo método ELISA), como também ao nível de peroxidação lípidica (método BODIPY-C11, em citômetro de fluxo). Também será avaliada a capacidade reprodutiva dos animais ao final do tratamento (100dpp) e a qualidade dos embriões por eles concebidos. (AU)

Resumo

A técnica de vitrificação de oócitos é de fácil execução, porém resultados satisfatórios exigem conhecimento teórico-prático e habilidade com os procedimentos. São etapas críticas o preparo dos meios crioprotetores e a execução das etapas de vitrificação e desvitrificação dos oócitos dentro dos tempos preconizados no protocolo experimental. As técnicas de produção in vitro de embriões são complexas e requerem um alto nível de organização da rotina laboratorial, desde o adequado preparo de material para a pesquisa e meios de cultura, envolvendo um rigoroso controle de qualidade, até a habilidade para a execução dos procedimentos de maturação, fertilização in vitro, capacitação espermática e cultivo embrionário. O bolsista designado para esta atividade deve apresentar conhecimento teórico e habilidade com as técnicas descritas, bem como perfil para a pesquisa científica e interface com outras áreas do conhecimento como a Química e Física. Objetivos 1-Realizar os procedimentos de aspiração folicular de ovários bovinos; 2-Realizar a técnica de maturação in vitro de oócitos bovinos e procedimentos correlatos; 3- Executar a técnica de vitrificação de oócitos bovinos e os procedimentos de desvitrificação, análise morfológica (teste de sobrevivência) e preparo de oócitos para a fecundação in vitro (FIV); 4-Executar as técnicas de produção in vitro de embriões; 5- Responsabilizar-se por todos os procedimentos laboratoriais e checagem de materiais necessários para a criopreservação e produção in vitro de embriões; 6-Registrar os dados referentes aos experimentos em planilhas específicas. 7-Preparar as soluções necessárias para a fixação e transporte de oócitos para análise de perfil lipídico; 8- Preparar oócitos para a realização das técnicas de microscopia confocal e imunofluorescência. (AU)

Resumo

O presente trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos do plasma seminal, oriundo da fração rica do ejaculado, sobre a capacitação e hiperativação espermática do sêmen suíno conservado sob refrigeração à 17ºC por 72 horas. Serão obtidos 6 ejaculados de 6 cachaços pelo método da mão enluvada. Em seguida o sêmen in natura será avaliado quanto às características da motilidade pelo sistema computadorizado de análise do sêmen (CASA), morfologia espermática por contraste de interferência diferencial e concentração espermática. Após essa primeira avaliação, os ejaculados serão acondicionados em tubos cônicos de 50 mL para serem divididos em três tratamentos, a saber: não centrifugado (NC), centrifugado e com o plasma seminal retirado pós-centrifugação (CS) e centrifugado resuspendido (CR). A força de centrifugação utilizada será de 500xg por 10 minutos. Todos os tratamentos serão submetidos à diluição em meio BTS para que se obtenha uma concentração de 30 x 106 espermatozoides/mL atingindo um volume final da DI de 50 ml. Em seguida, as amostras permanecerão por 90 minutos em temperatura ambiente e protegidas da luz antes de serem armazenadas. As doses com os diferentes tratamentos serão acondicionadas à temperatura de 17°C por 72 horas e após tal período, terão suas amostras transferidas para um meio capacitante seguido de acondicionamento em incubadora a 38°C com 5% de CO2. As mesmas serão avaliadas nos intervalos de 0, 2 e 4 horas, para os seguintes parâmetros: fluidez da membrana plasmática (capacitação), presença da fosforilação do aminoácido tirosina, integridade acrossomal (reação acrossômica), hiperativação e peroxidação da membrana plasmática e do citoplasma. Os resultados serão submetidos à análise de variância (PROC GLM), empregando-se o programa SAS (1998). Quando o principal efeito for significativo, as médias serão comparadas pelo teste de Tukey. (AU)

Resumo

O plasma seminal é um componente ambíguo do ejaculado suíno, possuindo componentes que podem gerar reações diversas, desde benéficas, minimizando o estresse oxidativo, até prejudiciais induzindo a capacitação espermática precoce. Nesse contexto, o presente trabalho visa verificar o efeito da ausência de plasma seminal nas doses inseminantes de suínos preservadas a 17°C por 72 horas. Para tanto, serão realizados três experimentos nos quais serão testados os diferentes tratamentos, a saber: não centrifugado (NC), centrifugado e com o plasma seminal retirado pós-centrifugação (CS) e centrifugado ressuspendido (CR). Serão avaliadas as consequências da retirada do plasma seminal sob a motilidade e viabilidade espermática, sob as alterações correlacionadas a capacitação espermática e também sob a fertilidade. Para os experimentos in vitro, as análises serão realizadas por sistema computadorizado de análise seminal (CASA) e citometria de fluxo a cada 24 horas. As taxas de fertilidade e prenhez serão avaliadas através de coleta de embriões cinco dias após a inseminação artificial em tempo fixo das fêmeas suínas. Os dados serão submetidos à análise de variância (PROC GLM), empregando-se o programa SAS (1998). As variáveis continuas serão comparadas pelo teste de Tukey, já a taxa de fertilidade e a taxa de parto serão analisadas pelo teste não-paramétrico de frequência Qui-Quadrado, ambos analisados ao nível de 5% de significância. (AU)

Resumo

O status oxidativo do espermatozoide atua sobre ele de diferentes formas, desde a capacitação até a fecundação do oócito. No entanto, as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ser benéficas ou prejudiciais dependendo do contexto celular. Tendo em vista a baixa proteção antioxidante do sêmen criopreservado, associado às sucessivas manipulações que antecedem a fecundação in vitro, entender como esta célula se comporta em um ambiente oxidante e os impactos deste sobre o embrião é de suma importância. Com isto, o objetivo deste trabalho foi propor um modelo dose-dependente para o estudo do estresse oxidativo sobre o espermatozoide e possível impacto no desenvolvimento embrionário. Para isto, no experimento 1, palhetas de sêmen criopreservado de touros (n=5) da raça Nelore foram submetidas à incubação por 1 hora a 38,5 oC e 5% CO2, com doses crescentes de peróxido de hidrogênio (0; 12,5; 25; e 50 µM). Ao final da incubação, os parâmetros de motilidade foram avaliados pelo sistema Computer Assisted System Analysis (CASA). No experimento 2, foram escolhidas duas doses de peróxido de hidrogênio com base nos resultados do experimento 1: alta (50 µM), baixa (12,5 µM) e também um controle (0 µM). Os espermatozoides foram incubados com as respectivas doses de peróxido de hidrogênio por 1 hora, e ao final da incubação foram utilizados para a fecundação in vitro (D=0). Neste experimento, além das análises do CASA, foram feitas avaliações do status oxidativo (CellROX® green e 2'-7'diacetato de diclorofluoresceína - DCFH), do potencial mitocondrial (JC-1), da cromatina (LA) e da capacitação espermática (clortetraciclina). Os embriões foram avaliados com relação à taxa de clivagem rápida (30 horas pós-inseminação), taxa de clivagem (D=3), taxa de desenvolvimento (D=5) e taxa de blastocisto (D=8). Para análise estatística foi utilizado o modelo de regressão polinomial, considerando pd0,05. Tanto no experimento 1 quanto no experimento 2 houve detrimento dose-dependente do peróxido de hidrogênio sobre o padrão de movimento e de porcentagem de células móveis. Houve aumento dose-dependente da porcentagem de células positivas para CellROX®, células capacitadas e positivas para o LA. Com relação às taxas de clivagem e de blastocisto, houve diminuição da porcentagem de embriões clivados e de blastocistos, conforme a dose de peróxido de hidrogênio foi aumentada. Referente à taxa de desenvolvimento embrionário, houve bloqueio das estruturas em 2-4 células. Nestas condições, o espermatozoide quando exposto a um ambiente oxidante, apresenta alterações no padrão de motilidade, no status oxidativo e na capacitação, sendo que estas interferem de forma negativa no desenvolvimento embrionário, desde o início da clivagem até a formação do blastocisto. (AU)

Resumo

A técnica de vitrificação de oócitos é de fácil execução, porém resultados satisfatórios exigem conhecimento teórico-prático e habilidade com os procedimentos. São etapas críticas o preparo dos meios crioprotetores e a execução das etapas de vitrificação e desvitrificação dos oócitos dentro dos tempos preconizados no protocolo experimental. As técnicas de produção in vitro de embriões são complexas e requerem um alto nível de organização da rotina laboratorial, desde o adequado preparo de material para a pesquisa e meios de cultura, envolvendo um rigoroso controle de qualidade, até a habilidade para a execução dos procedimentos de maturação, fertilização in vitro, capacitação espermática e cultivo embrionário. O bolsista designado para esta atividade deve apresentar conhecimento teórico e habilidade com as técnicas descritas, bem como perfil para a pesquisa científica e interface com outras áreas do conhecimento como a Química e Física.Objetivos1-Realizar os procedimentos de aspiração folicular de ovários bovinos;2-Realizar a técnica de maturação in vitro de oócitos bovinos e procedimentos correlatos;3-Executar a técnica de vitrificação de oócitos bovinos e os procedimentos de desvitrificação, análise morfológica (teste de sobrevivência) e preparo de oócitos para a fecundação in vitro (FIV);4-Executar as técnicas de produção in vitro de embriões;5-Responsabilizar-se por todos os procedimentos laboratoriais e checagem de materiais necessários para a criopreservação e produção in vitro de embriões; 6-Registrar os dados referentes aos experimentos em planilhas específicas.7-Preparar as soluções necessárias para a fixação e transporte de oócitos para análise de perfil lipídico;8-Preparar oócitos para a realização da técnica de espectrometria de massas (MALDI-MS) (AU)

Resumo

Umas das principais etapas no processo de criopreservação do sêmen é a curva de refrigeração. O ritmo de refrigeração pode diminuir o choque térmico e seus danos as células espermáticas, com isso melhores resultados na criopreservação poderiam ser melhorados utilizando-se curvas de refrigeração mais lentas e homogêneas, mas em alguns sistemas de refrigeração, como refrigeradores domésticos, isso não acontece. Com isso, o objetivo do trabalho é confrontar simultaneamente diferentes sistemas de refrigeração e criopreservação de sêmen bovino, e seus efeitos na qualidade do sêmen criopreservado. O delineamento experimental utilizado será inteiramente casualizado, em esquema fatorial 5x2, com 5 sistemas de refrigeração e 2 sistemas de criopreservação de sêmen, totalizando 10 tratamentos. Serão utilizados 2 ejaculados de 15 touros da raça Nelore, totalizando 30 ejaculados, sendo colhidos por meio de eletroejaculador. Os ejaculados serão diluídos em meio de fração única (BotuBov®) para concentração final de 60x106 spz/ml, após a diluição serão refrigerados por 5 horas em 5 sistemas diferentes de refrigeração (TK 4000® com curva de resfriamento de 0,25ºC/minuto; TK 4000® com curva de resfriamento de 0,5ºC/minuto, refrigerador Minitüb® 518C, BotuTainer® e refrigerador doméstico comum) e 2 de criopreservação (TK 4000® e isopor com nitrogênio líquido). A cinética espermática será realizada pelo aparelho IVOS (Versão 14, Hamilton-Thorne Bioscience) em três momentos: após 5 horas de refrigeração (antes da criopreservação), após a criopreservação e após o teste de termoresistencia rápida (TTR). Além disso, será realizada a avaliação da integridade de membrana plasmática, acrossomal e mitocondrial utilizando associação de sondas fluorescentes. As análises dos dados gerados ajudarão a elucidar qual melhor sistema de refrigeração e criopreservação que poderá beneficiar os técnicos que atuam no campo. (AU)

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