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Resumo

Técnicas baseadas em engenharia tecidual e na capacidade regenerativa do intestino, representam uma grande oportunidade como potenciais terapias alternativas para a Síndrome do Intestino Curto (SIC). O desenvolvimento de unidades organoides isoladas e capazes de produzir todas as linhagens celulares epiteliais representou um passo importante, sendo que uma promessa ainda maior reside no uso de células-tronco para gerar um intestino delgado a partir de Engenharia Tecidual (TESI, do inglês Tissue-Engineered Small Intestine). Técnicas recentes utilizam arcabouços artificiais tridimensionais e biodegradáveis, sobre os quais as unidades organoides podem se desenvolver, criando um cenário bastante promissor no que diz respeito ao tratamento da SIC. Contudo, as unidades organoides em crescimento, são dependentes de uma grande quantidade de energia, nutrientes e fatores de crescimento para serem funcionais. Portanto, formas de otimizar este processo fazem-se necessárias para o sucesso nesse tipo de tratamento, e a proteína R-Espondina1 recombinante humana (rhRSPO1), dado o seu potencial proliferativo em células tronco intestinais, juntamente com outros fatores peptídicos, como os rhVEGFs, pode ser uma peça chave. As proteínas RSPO compõem uma família de proteínas secretadas conhecidas por seus papeis importantes na proliferação, diferenciação e morte celular, induzindo a via de Wnt. Atualmente, sabe-se que a via de WNT/²-catenina é importante para manter o epitélio intestinal, regulando o processo de auto-renovação, que ocorre no eixo vilosidade-cripta, através dos ligantes canônicos de WNT, que funcionam como mitógenos de células progenitoras da cripta. Dentre as RSPOs, a RSPO1 tem esta capacidade mitogênica no epitélio intestinal, com efeitos desprezíveis na maturação e migração de células diferenciadas ao longo do eixo vilosidade-cripta. Por este motivo, a RSPO1, destaca-se das demais no que diz respeito ao seu potencial uso terapêutico na área de Medicina Regenerativa para regeneração de intestino. Este potencial vem sendo confirmado por diversos estudos que tem evidenciado o uso de RSPO1 em modelos animais em casos de mucosite intestinal induzida por quimioterápicos e Doenças Inflamatórias Intestinais. Além disso, Lgr4, um dos receptores da família Lgr ao qual RSPO1 liga-se, é coexpresso com RSPO1 em células-tronco, sendo detectável em todas as outras células progenitoras, confirmando a hipótese de que RSPO1 seria capaz de induzir a proliferação nestas células. Outros estudos demonstraram, ainda, que as células-tronco intestinais Lgr5+ isoladas podem ser mantidas in vitro e induzidas à propagar organoides continuamente. Dessa forma, futuras tentativas de reconstituir o tecido epitelial danificado por doenças ao longo do trato gastrointestinal provavelmente vão explorar a expansão ex-vivo dos epitélios de interesse, mediada por RSPOs. Portanto, o trabalho aqui proposto tem, por objetivo, dar continuidade à colaboração previamente estabelecida com o grupo da Prof. Tracy C. Grikscheit, da University of Southern California em Los Angeles e do Saban Research Institute do Children's Hospital Los Angeles, Califórnia, EUA, pelo ex-aluno de Doutorado (Gustavo G. Belchior), que iniciou a análise da atividade biológica das isoformas de rhVEGF sobre a cultura de unidades organoides murinas, visando à formação do TESI. No presente trabalho, será testada a atividade biológica da rhRSPO1, que foi produzida a partir de clones celulares HEK293 e CHO-DG44 superprodutores e purificada em nosso laboratório, sobre a cultura de unidades organoides murinas e a formação do TESI, individualmente ou combinada aos VEGFs. A proteína rhRSPO1 já está sendo produzida em nosso laboratório nos dois sistemas celulares (HEK293 e CHO-DG44), com atividade biológica in vitro demonstrada e purificação em andamento. A otimização do processo de purificação da rhRSPO1, que está em curso, deve levar à uma rhRSPO1 altamente purificada para ser utilizada neste projeto. (AU)

Resumo

O Workshop terá na primeira parte aulas e seções de laboratório para estudantes de pós-graduação abordando os seguintes aspectos: Doença de Chagas e Pesquisa; Transmissão e resposta do hospedeiro; Metabolismo de DNA, regulação da expressão Gênica, mecanismos de invasão celular, metabolismo e quimioterapia. Todos os professores convidados são lideres de grupos de pesquisa. Após o curso haverá um simpósio sobre o impacto das tecnologias atuais na prevenção e controle de doenças causadas por Trypanosomas. (AU)

Resumo

O câncer cervical, um tipo de tumor maligno que acomete a parte inferior do útero, é o terceiro tumor mais frequente em mulheres, causado principalmente pela infecção persistente por alguns tipos oncogênicos do Papilomavírus Humano (HPV). Apesar da capacidade de diagnóstico e prevenção ter evoluído nas últimas décadas por meio de vacinas contra o HPV e de exames de Papanicolaou, o câncer cervical ainda é muito incidente na população feminina, principalmente de baixa renda, que não tem acesso a esses recursos. Assim, recorre-se ao tratamento que envolve radioterapia, cirurgia ginecológica e quimioterapia, os quais provocam uma série de inconvenientes como a remoção do útero e ovários, além dos efeitos colaterais com a administração dos quimioterápicos convencionais, como vômitos, náuseas e queda de cabelos. Dessa forma, a busca por moléculas bioativas para tornar o tratamento do câncer cervical mais funcional e clinicamente viável torna-se necessária. Assim, a descoberta de fármacos peptídicos, como o CTT1, que mostrou ação antitumoral in vitro e in vivo pela inibição das metaloproteinases de matriz (MMP), enzima muito expressa por células tumorais cervicais, é uma estratégia interessante para terapia antitumoral do câncer cervical. No entanto, o uso clínico de peptídeos enfrenta muitos desafios, decorrentes principalmente de suas características físico-químicas e baixa biodisponibilidade oral, o que implica na administração pela via parenteral, o que resulta em baixa adesão dos pacientes ao tratamento devido à necessidade de repetidas injeções, que podem provocar tromboflebite e necrose tecidual. Assim, a estratégia de incorporá-lo em um sistema de liberação para administração vaginal visando o tratamento localizado pode possibilitar um tratamento adequado, seguro e efetivo para o câncer cervical, uma vez que a mucosa vaginal apresenta uma série de vantagens, dentre elas, alta permeabilidade e alta irrigação sanguínea. Dentre os sistemas de liberação de fármacos, os sistemas nanoestruturados precursores de cristais líquidos (SPCL) com adjuvantes poliméricos catiônicos mucoadesivos surgem como uma valiosa estratégia para administração vaginal do CTT1 a fim de fornecer uma liberação controlada e a vetorização do peptídeo. Portanto, esse projeto tem como objetivo desenvolver um SPCL constituído por álcool cetílico etoxilado 20 e propoxilado 5, ácido oleico e fase aquosa contendo dispersão polimérica de quitosana associada ou não à polietilenoimina para administração vaginal do peptídeo CTT1 e, posteriormente, investigar a ação citotóxica in vitro e in vivo das formulações. Desta forma, pretende-se desenvolver um sistema de liberação nanoestruturado para potencial aplicação no tratamento do câncer cervical. (AU)

Resumo

Carcinomas são neoplasias malignas derivadas de células epiteliais e representam a forma mais comum de câncer humano, é uma das doenças mais comuns, sendo a segunda causa de morte mundial. Os carcinomas de colo de útero e de cabeça e pescoço causam muitas mortes em países em desenvolvimento. O tratamento desses tipos de tumores inclui cirurgia, terapia por irradiação e quimioterapia. Entretanto estes métodos são altamente invasivos, podendo causar lesões estéticas irrecuperáveis, com um significativo comprometimento funcional. Em função disso, algumas plantas vêm sendo utilizadas no tratamento do câncer e uma delas tem despertado interesse científico, a Piper cubeba, utilizada no tratamento fitoterápico de gonorreia, sífilis, dores abdominais, diarreia, enterite, asma e tumores em geral. Em função da importância da atividade antitumoral das lignanas extraídas da Piper cubeba, incluindo seus elementos químicos, foi proposto o presente trabalho que tem como objetivo geral avaliar o potencial efeito citotóxico e genotóxico de lignanas nas células neoplásicas sobre a morfologia, proliferação e migração celular, citotoxicidade, genotoxicidade, apoptose e necrose celular e expressão gênica e protéica, observando como o fitoterápico age e como essas alterações podem participar do processo tumorigênico. Para isso serão utilizadas quatro linhagens de células tumorigênicas e uma linhagem de células normais, após o tratamento com as lignanas cubebina, hinoquinina, dihidrocubebina, etilcubebina e metilcubebina, todas extraídas das sementes de Piper cubeba. Assim poderemos entender um pouco dos mecanismos e das interações desse fitoterápico no processo tumorigênico. (AU)

Resumo

Inositolfosforilceramida (IPC), esfingolipídeo majoritário presente no gênero Leishmania, e não expresso em mamíferos, pode ser considerado como molécula alvo para quimioterapia contra leishmaniose. Leishmania (Viannia) braziliensis é endêmica na America Latina e causa leishmaniose tegumentar Americana. Neste trabalho, utilizando-se um anticorpo monoclonal específico para IPC, foi demonstrado que estas moléculas estão localizados internamente no parasita. O tratamento de Leishmania (Viannia) braziliensis com miriocina 5 µM ( inibidor de serina palmitoiltransferase) reduziu cerca de 8 vezes a infectividade de formas promastigotas em infecções experimentais, utilizando-se Golden Hamsters, conforme determinado pelo número de parasitas em linfonodos inguinais após 8 semanas de infecção, sugerindo a importância do IPC ou derivados esfingolipídicos na infectividade desses parasitas ou na sobrevivência no hospedeiro. IPCs foram purificados de promastigoitas de três linhagens de L. (V.) braziliensis e analisados por espectrometria de massas em modos positivo e negativo. Os ions majoritários de IPC foram apresentaram eicosaesfinganina e eicosaesfingosina. ESI-MS em modo negativo revelou espécies de IPC em m/z 778.6 (d20:1/14:0), 780.6 (d20:0/14:0), 796.6 (t20:0/14:0), 806.6 (d20:1/16:0), e 808.6 (d20:0/16:0). IPCs isolados de L. (V.) braziliensis e L. (L.) major mostraram diferenças significantes na composição da ceramida dos IPCs. O íon majoritário do IPC de L. (L.) major, detectado por ESI-MS em modo negativo em m/z 780.6, apresentou ceramida d16:1/18:0. Nossos resultados sugerem que a esfingosina sintase (também conhecida como serina palmitoiltransferase; SPT) em L. (V.) braziliensis é responsável pela síntese de bases esfingoides de o20 carbonos (d20), enquanto a SPT em L. (L.) major sintetiza cadeias de bases esfingoides de 16 carbonos (d16). A árvore filogenética de proteínas SPTs foi construída pelas análises de seqüências homólogas em espécies de Leishmania dos subgêneros Leishmania e Viannia. Os resultados obtidos indicam que a posição do gene da SPT em L. (V.) braziliensis encontra-se completamente separado daqueles de membros do subgênero Leishmania, incluindo L. (L.) major, L. (L.) infantum, e L. (L.) mexicana. Nossos resultados demonstram claramente diferenças nas bases esfingoides entre L. (V.) braziliensis e membros do subgênero Leishmania, e são relevantes para o desenvolvimento de novos fármacos mais específicos e eficientes para o tratamento de leishmaniose. (AU)

Resumo

A incidência de câncer tem crescido nas últimas décadas. O desenvolvimento de novos estudos em prevenção e tratamento para estas doenças tem motivado inúmeros grupos de pesquisa ao redor do mundo. Mesmo assim, o conhecimento sobre etiologia ainda é escasso e tratamentos já estabelecidos são conhecidos por causar vários efeitos colaterais em pacientes, especialmente nas gônadas. As mulheres submetidas à quimioterapia podem desenvolver disfunção das gônadas, tornarem-se inférteis e exibirem menopausa iatrogênica ou induzida. Para esses pacientes, as biotecnologias reprodutivas, como a criopreservação e transplante de tecido ovariano, são uma fonte interessante para auxiliar na retomada da função das gônadas e recuperar a fertilidade. Dessa forma, os objetivos deste projeto de estágio são: 1) realizar imunohistoquímica e western blotting em tecido mamário e ovariano de gerbil, obtido a partir dos experimentos desenvolvidos durante o doutorado na UNESP e; 2) participar em um novo projeto extra, elaborado pelo GYNE / IREC / UCL e ganhar experiência em técnicas como criopreservação de tecidos, avaliação de ultraestrutura com microscopia eletrônica de transmissão (MET), tomografia computadorizada de raios X, cultura de tecido in vitro e in vivo com tecido ovariano humano e bovino após criopreservação. Para a glândula mamária do gerbil e tecido ovariano, já obtidos na UNESP, será desenvolvida a imuno-histoquímica de dupla marcação para alguns marcadores não disponíveis em nossa instituição e já desenvolvidos no IREC, como Cx43 e KI67. Pretende-se também realizar a técnica de western blotting no tecido da glândula mamária do gerbil para a detecção da proteína EZH2 e Esr-1. Além dessa complementação do projeto de doutorado, será desenvolvido um experimento para estabelecer um protocolo de vitrificação do tecido ovariano. Primeiramente, um teste será realizado em ovários bovinos, que serão descongelados, cultivados in vitro e transplantados para camundongos Nude. Como segunda parte do experimento, biópsias ovarianas humanas serão obtidas de pacientes para comparar o novo protocolo de vitrificação a um método de congelamento lento. Posteriormente, os fragmentos de tecido aquecidos ou descongelados serão xenotransplantados para camundongos Nude durante 6 meses. A avaliação do tecido ovariano enxertado incluirá tomografia computadorizada de raio-X para certificar a perfusão de crioprotetor antes da vitrificação; imuno-histoquímica para proliferação (KI67), apoptose (TUNEL e caspase-3 activa), vascularização (CD-34) e detecção de antígenos de maturação de vasos (±-ASMA); e MET para integridade de membrana e avaliação de lisossomos. O desenvolvimento de todas as técnicas aqui propostas deve contribuir para a melhoria das nossas capacidades laboratoriais e consequentemente a qualidade e visibilidade das publicações. Permitirá também o estabelecimento de um novo campo de pesquisa em nosso grupo, como a morfologia do trato reprodutivo feminino. (AU)

Resumo

O meduloblastoma é o tumor maligno do sistema nervoso central com maior prevalência em pacientes pediátricos e a principal causa da morbidade e mortalidade na oncologia pediátrica. Estudos recentes identificaram 4 subgrupos moleculares de meduloblastoma com base no perfil transcricional, mutacional, citogenético e epidemiológico, estes grupos são: WNT, SHH, Grupo 3 e Grupo 4. O subgrupo molecular SHH que possui o TP53 mutante apresenta resistência ao Vismodegib ( inibidor de SMO) prognóstico ruim e pouco está descrito os mecanismos moleculares envolvidos neste fenótipo agressivo. A via de sinalização TGF-B e Hippo estão aberrantemente ativadas em diversos tipos de tumores e podem exercer "cross-talks" com outras vias moleculares contribuindo para a resistência a quimioterápicos e baixa taxa de sobrevida. O complexo Smad2/3-YAP foi recentemente descrito e é considerado efetor final e "nó"molecular entre a via TGF-B e Hippo, ocasionando amplificação de diversos fatores de transcrição como o GLI-2, proteína pertencente a via Sonic Hedgehog e envolvida na resistência primária do meduloblastoma TP53 mutante ao inibidor Vismodegib. Este projeto visa desenvolver modelos duplo Knockout de Smad2/3 e YAP com o uso da tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas9 em linhagens de MB TP53 mutantes e selvagens. Após avaliar a expressão de GLI2, as células serão tratadas com o Vismodegib e será avaliada a proliferação, apoptose e invasão. A segunda etapa do projeto consiste no inóculo ortotópico destas linhagens Duplo KO em camundongo e tratamento com o mesmo inibidor. A expectativa é que a conclusão desse projeto esclarecerá aspectos da regulação da resistência do meduloblastoma SHH TP53 ao inibidor Vismodegib, e que essas informações poderão ser utilizadas para o aprimoramento do prognóstico e tratamento da doença. (AU)

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Uma etapa essencial ao ciclo de vida dos parasitas que causam a malaria e a saida da hemacia infectada ou egresso. Este processo e precedido por uma permeabilizac'ao progressiva das membranas do vacuolo parasitoforo e da hemacia infectada e depende da ac'ao de quinases, fosfatases, proteases, perforina(s), alem de moleculas ainda nao identificadas, sendo regulado por vias de sinalizac'ao do parasita e da celula hospedeira. Muitos estudos previos apresentam limitac'oes na sincronizac'ao dos parasitas e na quantificac'ao da permeabilizac'ao das membranas, dificultando a identificac'ao precisa da ordem em que os eventos ocorrem, bem como das moleculas envolvidas. De forma a contornar essas dificuldades, neste projeto serao utilizadas linhagens transgenicas de Plasmodium falciparum que sao nocaute condicional para as quinases PKG ou CDPK5, essenciais ao egresso. Estas linhagens tambem expressam o reporter luminescente nano- luciferase (Nluc) de forma soluvel no vacuolo parasitoforo (PV) ou no citosol da hemacia infectada (RBC). Esta estrategia permitira sincronizar os parasitas no momento que precede a ativac'ao de PKG ou CDPK5, de forma que a permeabilizac'ao das membranas do vacuolo parasitoforo (PVM) e da celula hospedeira (RBCM) seja quantificada ate o rompimento dos esquizontes e o egresso dos merozoitas. De modo similar, o efeito de inibidores enzimaticos, agonistas e antagonistas sobre o egresso sera avaliado. Esses resultados poderao aprofundar nosso conhecimento sobre os processos celulares que levam ao egresso e contribuir para a validac'ao de inibidores especificos, que eventualmente se tornem quimioterapicos. (AU)

Resumo

Nos dias de hoje, o câncer representa um dos maiores desafios para a ciência e para a prática médica no homem. Quanto aos animais, o problema não é diferente: há necessidade de se intensificar as pesquisas em Oncologia Veterinária, em todas as suas vertentes, particularmente no que concerne a novos tratamentos para neoplasias de animais. A eficiência de um agente antineoplásico para tratamento de um câncer específico pode ser definitivamente determinada por meio de ensaios clínicos. Entretanto, devido a razões éticas, as pesquisas têm de se iniciar em sistemas experimentais. O presente projeto tem por objetivo investigar a atividade o peptídeo Q-conexina carboxil-terminal (ACT1) como uma possível nova terapia antineoplásica para tumores mamários caninos, realizando ensaios pré-clínicos in vitro. O peptídeo ACT1 permite examinar especificamente a atividade endógena da conexina 43 (Cx43) em junções de comunicação, sem alterar os níveis de expressão da Cx43, este peptídeo e formado por 25 aminoácidos (ACT1) que imita o domínio citoplasmático de Cx43 normal. Neste projeto, o peptídeo ACT1 será testado em cultivos de tumores mamários caninos e estes comparados com linhagens mamárias tumorais humanas. Serão utilizadas linhagens primárias (Brisa e Leka) de tumores mamários caninos, pertencentes ao Laboratório de Oncologia Experimental e comparada da FMVZ, e a linhagem de tumor mamário canino comercial denominado CF41. As linhagens humanas utilizadas serão a MCF10a, MCF-7. Seguir-se-á o tratamento com o peptídeo ACT1 em doses referidas na literatura (50, 100 e 200 ¼M) associados ou não ao inibidor de histonas desacetilases o Butirato de sódio - NaB (0.1, 0.5, 0.75mM), e diferentes combinações destas substâncias entre si e as associações das mesmas com antineoplásicos clássicos como o citrato de tamoxifen (10¼M) e o lapatinib (10 e 50nM). Tanto a proliferação quanto a morte celulares serão quantificadas. Estudos já comprovaram que o peptídeo ACT1 melhora a atividade dos quimioterápicos tamoxifen e lapatinib, esperamos com este estudo da associação de um inibidor de histona desacetilase melhorar ainda mais a ação destes fármacos utilizados no tratamento de tumores mamários. E desta forma, avançar em novas terapias antineoplásicas, obtendo resultados importantes que permitirão, oportunamente, a condução de ensaios pré-clínicos e clínicos em cães. (AU)

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A crescente incidência de câncer de pele do tipo melanoma, bem como sua resistência à terapia antineoplásica convencional, faz com que ele seja uma das questões mais desafiadoras em oncologia, com isso a busca por novos fármacos é constante. Os produtos naturais marinhos são importante fonte de agentes atineoplásicos. A prodigiosina é um bioproduto bacteriano, isolado a partir de diversas espécies de bactérias tanto gram-negativas quanto gram-positivas, que demonstrou capacidade anti-proliferativa em diversas linhagens tumorais e redução na expressão de survivina em linhagens de câncer de mama. A survivina é uma proteína inibidora de apoptose, com baixa expressão em tecidos normais, mas altamente expresso nos tumores, além de estar relacionada à resistência a quimioterapia. A partir da prospecção de bactérias produtoras de compostos bioativos no litoral brasileiro, nosso grupo de pesquisa isolou quatro prodigininas: prodigiosina (m/z 324.2059 [M + H]+), ciclononilprodigiosina (m/z 364,2294 [M + H]+), nonilprodigiosina (m/z 366,2453 [M + H]+) e metilciclooctilprodigiosina de microorganismos marinhos. Estudos preliminares em nosso laboratório demonstraram que a prodigiosina e seus derivados apresentam citotoxicidade em duas linhagens de melanoma: SkMel 19 (mutação em BRAFV600E) e SkMel 147 (mutação em NRAS), sendo mais ativa na linhagem SkMel 19. Os genes mutados nessas linhagens são componentes fundamentais da via MAPK, que participa dos processos normais de crescimento e sobrevida das células, e a mutação nos mesmos leva a ativação constitutiva da via, causando proliferação exacerbada. Este trabalho visa caracterizar os efeitos da destas prodigininas em linhagens de melanoma com mutação em BRAF/NRAS e a participação da survivina nos efeitos obesrvados. Para isso utilizaremos testes de citotoxicidade e analisaremos se há modulação por parte da prodigiosina e derivados na expressão de genes da via MAPK e survivina nas linhagens celulares de melanoma. (AU)

Resumo

Esta proposta é dividida em duas partes principais, conforme determinado pelas proteínas de interesse: (1) cristalização e determinação da estrutura carreador mitocondrial de piruvato humano; (2) caracterização estrutural do complexo VDAC2-Bak da membrana externa mitocondrial humana por crio-microscopia eletrônica de partícula única.(1) O transporte ativo de piruvato glicolítico através da membrana mitocondrial interna (IMM) humana envolve duas subunidades carreadoras, MPC1 e MPC2, associadas em uma estrutura heterotípica oligomérica de 150 kDa. Nosso grupo demonstrou que a MPC2 humana homodimérica pode promover o transporte eficiente de piruvato em proteolipossomas reconstituídos in vitro. É importante notar que os requisitos funcionais derivados e as características cinéticas se assemelham aos já demonstrados para o transporte de piruvato em extratos mitocondriais. Nossos resultados estabelecem a estrutura inicial para explorar o papel independente da MPC2 na homeostase e doenças relacionadas à desregulação do metabolismo do piruvato. No entanto, para a desrição das base moleculares do transporte de piruvato, a determinação da estrutura atômica da MPC2 humana torna-se de grande importância. Neste contexto, propõe-se continuar a nossa colaboração bem sucedida com o Laboratório de Proteínas de Membranas (MPL), a fim de cristalizar MPC2 e coletar dados de difração de raios-X usando instalações de última geração e abordagens experimentais. A experiência adquirida trará benefícios na area de fronteira da biologia estrutural de proteínas de membrana.(2) Também conhecidas como porinas mitocondriais, VDACs (voltage-dependent anion-selective channel) são as proteínas integrais mais abundantes na membrana externa mitocondrial e considerada um novo alvo para medicamentos anti-cancer. Bak (Bcl-2-homologous antagonist/killer) pertence aos membros pro-apoptóticos da família de proteínas Bcl-2 e é constitutivamente integrada na membrana externa mitocondrial. Em células saudáveis, VDAC2 e Bak estão formam um complexo onde Bak aparece inativado ou reprimido. Os mecanismos de associação e dissociação do complexo VDAC2-Bak estão intimamente relacionados com a via apoptótica mitocondrial. Estudos demonstraram que a interferência neste complexo induz a morte celular programada em melanoma, um tipo de câncer com alta resistência às quimioterapias tradicionais e onde a deficiência homozigótica VDAC2 é letal para embriões de camundongo. Embora haja uma compreensão razoável do mecanismo regulatório de Bak, pouco se sabe sobre as funções do complexo VDAC2-Bak. Este projeto visa estabelecer bases para a investigação estrutural do complexo formado por VDAC2 e Bak e obter informações estruturais pelo método crio-microscopia eletrônica (Cryo-EM) por análise de partículas únicas. Para isso, as linhas celulares heterólogas serão estabelecidas para a produção de VDAC2 e Bak recombinantes, visando a subsequente purificação do complexo alvo. Após a purificação, as condições de investigação para o complexo por Cryo-EM serão inicialmente definidas pela técnica de coloração negativa (negative staining) e, em seguida, preparada em gelo amorfo). A obtenção de imagens do complexo puro permite o processamento pela técnica de Análise de Partículas Únicas. O modelo estrutural do complexo contribuirá na elucidação de como Bak interage estruturalmente com VDAC2, abrindo caminho para futuros estudos de utilização do complexo como alvo terapêutico. (AU)

Resumo

O melanoma é responsável pela maioria das mortes entre cânceres de pele. A quimioterapia convencional e paliativa é limitada graças ao desenvolvimento de quimioresistência. Nós usamos uma analise proteômica para identificar respostas celulares que leva à quimioresistência de linhagens de melanoma humano à cisplatina. Uma abordagem de biologia de sistemas nos dados do proteoma mostrou que a participação de processos celulares específicos como a fosforilação oxidativa, homeostase e organização mitocondrial, bem como a resposta a proteínas mal enoveladas são requeridas para a sobrevivência de células tratadas com cisplatina. Proibitina está entre as proteínas acumuladas de maneira consistente, interagindo com clusters funcionais associados com resistência à cisplatina. Nós mostramos que a proibitina acumulou em diferentes níveis em linhagens celulares de melanoma sobre estímulos de estresse como: tratamento com os quimioterápicos temozolamida, dacarbazina ou cisplatina; privação de soro fetal bovino; tratamento com tunicamicina, um indutor de proteínas mal enoveladas. Proibitina acumula na mitocôndria de células de melanoma após tratamento com cisplatina e tunicamicina e seu acúmulo de novo leva à quimioresistência em linhagens de melanoma. Em contraste, a inibição de proibitina sensibiliza linhagens de melanoma ao tratamento com cisplatina e tunicamicina. Nós concluímos que proibitina participa da sobrevivência de células expostas à diferentes estímulos de estresse e pode, assim sendo, servir como um alvo para a sensibilização de células de melanoma à quimioterapia. (AU)

Resumo

A presente proposta é fundamentada em resultados anteriormente obtidos para uma série de compostos N'-[(benzofuroxan-5-il)metileno]benzohidrazidas substituídos. Estes compostos, que demonstraram potente atividade citotóxica em diferentes linhagens de células tumorais, que superexpressam a proteína MDMX. Esta proteína é a responsável pela deficiência funcional de p53 em tumores, como o melanoma, que, mesmo apresentando p53 do tipo selvagem, tem a funcionalidade desta proteína inibida. No entanto, o câncer é uma doença multifatorial, o que impõe a necessidade de agregar, no planejamento de novos fármacos, diferentes perfis farmacodinâmicos, capazes de modular distintas vias de sinalização, em apenas uma molécula, criando-se, assim, fármacos "multialvos". Por sua vez, o melanoma é a neoplasia mais agressiva dentre os cânceres de pele e apresenta elevada resistência a vários agentes quimioterápicos, sendo necessário o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas a ele dirigidas. Neste contexto, a presente proposta visa identificar o mecanismo de ação em nível molecular de dois isômeros estruturais, BFD-3A e BFD-4A, planejados racionalmente por LBDD para atuarem na MDMX e por SBDD para atuarem na proteína BRAF (importante alvo terapêutico em melanomas). O projeto identificará o mecanismo de ação molecular na MDMX, e também na proteína PDL1, uma vez que já foram identificados o efeito destes compostos no sistema imune. Estas observações indicam que esta estrutura tem o potencial de agir em vários alvos da célula tumoral, sugerindo que sua escolha como arcabouço estrutural, associada à estratégia de planejamento racional baseado na estrutura do ligante, permitirá a identificação de novos análogos/derivados com atividade multialvo e, portanto, com maior probabilidade de eficácia anti-neoplásica. (AU)

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O câncer de colo uterino é um dos principais tipos de câncer entre as mulheres, sendo responsável por aproximadamente 4% das mortes por câncer no mundo. A partir da década de 70, acumularam-se evidências da associação entre este tipo de câncer e a infecção pelo Papilomavírus humano (HPV), que é responsável por 99,7% dos tumores. Dentre os tipos de HPV, o 16 e 18 estão entre os classificados como de alto risco oncogênico, característica essa devida aos genes virais E6 e E7 que mediam a degradação das proteínas celulares p53 e pRb, respectivamente. O tratamento envolve geralmente a Cisplatina, um quimioterápico alquilante de DNA que apresenta alta toxicidade. A quinase ATR (ataxia-telangiectasia mutated (ATM) e RAD3-related kinase) é uma enzima essencial para a viabilidade replicativa de células humanas e sua ativação está especialmente relacionada à presença de DNA simples fita, formado durante os processos de reparo e replicação do DNA lesado. Ela também fosforila uma série de substratos, entre eles a proteína CHK1 cuja ativação gera um efeito em cascata que impede a progressão do ciclo celular para a mitose. O tratamento com o inibidor específico de ATR Ve-821 tem se mostrado capaz de sensibilizar células tumorais à radiação ionizante e a diferentes quimioterápicos. Tal propriedade é especialmente interessante para reduzir a toxicidade de tratamentos e a resistência tumoral. Assim, este projeto se propõe a avaliar o efeito sinergístico entre a transformação celular por HPV e inibição da quinase ATR, frente ao tratamento com cisplatina, na expectativa de melhor entender os mecanismos desse efeito e obter perspectivas para o protocolo terapêutico desses tumores. (AU)

Resumo

O carcinoma de ovário é a quinta causa de morte referente a neoplasias malignas em mulheres. Deste modo, nos últimos anos, esforços vêm sendo realizados para demostrar que marcadores genéticos, como os polimorfismos, herdados por mulheres com carcinoma de ovário podem predizer na resposta, resistência e toxidade à quimioterapia com derivados da platina e paclitaxel e a sobrevida. Além disso, no carcinoma de ovário, a cirurgia e a quimioterapia alteram a qualidade de vida. Os objetivos deste estudo são avaliar 1) a associação entre marcadores genéticos herdados em mulheres com carcinoma de ovário com a resposta quimioterapia e reações adversas com carboplatina e paclitaxel, sobrevida livre de progressão, sobrevida global; 2) e nos casos novos, avaliar a relação entre as variáveis acima citadas e a qualidade de vida. Para esse estudo de coorte observacional serão incluídas pacientes com carcinoma de ovário atendidas no Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti - Centro de Atenção Integral a Saúde da Mulher (CAISM) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) que receberem carboplatina e paclitaxel como tratamento da doença. Para o objetivo 1) serão incluídas amostras de soro e plasma do sangue de 136 mulheres com carcinoma de ovário mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Biobanco do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM-UNICAMP) (CONEP B-056). Os marcadores genéticos correspondentes a polimorfismos de detoxificação, de reparo de DNA, relacionados a apoptose celular, e angiogênese serão analisados por meio de PCR e digestão enzimática ou PCR em tempo real. Todas as toxicidades detectadas serão documentadas e classificadas segundo sua gravidade. Para o objetivo 2) será aplicado um questionário de qualidade de vida nas mulheres com carcinoma de ovário atendidas como casos novos e que iniciarão quimioterapia com carboplatina e paclitaxel. O questionário será aplicado antes da quimioterapia, no quarto e no sexto ciclo e um ano após o termino da quimioterapia. Os dados demográficos e clínicos das participantes do estudo serão obtidos através do prontuário. Os dados adquiridos e anotados na ficha de coleta serão transferidos para planilhas eletrônicas tipo Microsoft Excel. Os dados serão analisados através do pacote estatístico R. O nível de significância assumido será de 5%. (AU)

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O câncer de cabeça e pescoço corresponde aos tumores localizados no trato aerodigestivo superior. O tratamento mais efetivo consiste na radioterapia concomitante à quimioterapia com altas doses de cisplatina, entretanto, seu uso é limitado devido às suas reações adversas, principalmente nefrotoxicidade, causadas por estresse oxidativo. O complexo enzimático CYP450 é responsável por metabolizar uma grande variedade de compostos lipofílicos de natureza endógena e exógena. Estudos sugerem que presença da subfamília CYP2E1, encontrada em tecidos como os do túbulo proximal renal, predispõe um aumento no risco de desenvolvimento de nefrotoxicidade em comparação àqueles que não expressam esta subfamília enzimática. O objetivo deste estudo será verificar uma possível relação dos polimorfismos no gene da CYP2E1 com estresse oxidativo celular induzidos por cisplatina em pacientes com câncer de cabeça e pescoço. Serão incluídos pacientes com câncer de cabeça e pescoço que realizarão tratamento antineoplásico com cisplatina (80-100mg/m2 a cada 21 dias, por 3 ciclos; sendo considerado para a análise apenas o 1º ciclo) concomitante a radioterapia. O estresse oxidativo celular será mensurado pelos testes AmplexRed e MitoSox Red. Os polimorfismos rs3813867, rs3813865, rs8192772 da CYP2E1 serão detectados por Polimorfismos no Comprimento de Fragmentos de Restrição (PCR-RFLP). (AU)

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O melanoma cutâneo (MC) merece destaque entre os tumores malignos devido ao seu alto potencial metastático e à refratariedade terapêutica. A via de sinalização Janus kinase/Signal tranducer (JAK/STAT), com as proteínas JAK1, JAK2 e STAT3, regula o desenvolvimento, a progressão e o potencial metastático do tumor. As proteínas JAK1, JAK2 e STAT3 são codificadas por genes polimórficos em humanos e, assim, é possível que indivíduos normais apresentem diferenças herdadas na funcionalidade da via JAK/STAT, com consequentes diferentes riscos para a ocorrência do MC e diferentes aspectos clinicopatológicos do tumor. Os objetivos do estudo são os de verificar se polimorfismos gênicos de nucleotídeo único (SNPs) no gene JAK1 (c.1648+1272A>G, c.991-27C>T), JAK2 (c.-1190G>T, c.-2428T>A) e STAT3 (c.*1671C>T, c.-1697C>G) influenciam o risco, as manifestações clínicas e biológicas e a sobrevida dos pacientes com MC, bem como as expressões dos referidos genes e proteínas. Serão avaliados 260 pacientes com MC atendidos nos ambulatórios de Oncologia Clínica e Dermatologia do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e 260 controles, doadores de sangue, do Hemocentro da UNICAMP, pareados por idade,sexo, raça e ancestralidade. Os pacientes receberam terapêutica com cirurgia, radioterapia e quimioterapia. As genotipagens serão realizadas por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR). As expressões gênicas dos três genes serão realizadas pelo PCR quantitativo. As expressões das três proteínas serão analisadas por imunohistoquímica em tumores emblocados em parafina. A expressão gênica e a quantificação de proteínas de um dos SNPs de interesse, ou seja, aqueles que apresentam associação com risco, manifestações clinicopatologicas e/ou sobrevida serão complementados pelo PCR quantitativo e western blot, respectivamente, em linhagem celular de melanoma A-375 modificada geneticamente para apresentar os genótipos homozigoto selvagem e homozigoto variante. Será verificado se os lóci dos SNPs estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg em amostras de pacientes e controles. A análise da ancestralidade será calculada utilizando o programa STRUCTURE v 2.3.3. O significado estatístico das diferenças entre grupos será calculado pelo teste de Fisher ou qui-quadrado. Os riscos de ocorrência do MC, a que pacientes e controles foram submetidos, serão obtidas por meio das razões das chances. As comparações de expressões gênica e proteica serão realizadas por meio dos testes t e ANOVA ou teste de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis. As análises de sobrevida serão calculadas pelo Kaplan-Meier e teste do log-rank e por análises de Cox. Acreditamos que os resultados deste estudo poderão contribuir para identificar indivíduos com alto risco para a ocorrência do tumor ou de tumores ainda mais agressivos, que mereçam receber atenção especial na prevenção, diagnóstico precoce ou terapêutica diferenciada. (AU)

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O número de pacientes vivendo com câncer tem aumentado nos últimos anos em todo mundo. Até 70% dos pacientes com câncer recebem algum tipo de quimioterapia ao longo do seu tratamento e muitas dessas drogas apresentam potencial nefrotóxico. Os pacientes com câncer constituem população de risco para nefrotoxicidade aguda devido à idade avançada, presença de múltiplas comorbidades, e diversos estudos demonstraram a ocorrência de injúria renal aguda secundária a quimioterápicos através de múltiplas vias fisiopatológicas como toxicidade tubular direta (platinas, antracíclicos), microangiopatia trombótica (gemcitabina, inibidores do VEGF), e lesão por cristais (metotrexate). No entanto, poucos estudos analisaram prospectivamente a ocorrência de nefrotoxicidade crônica. Nestes estudos o método de avaliação da função renal usualmente utilizado foi o ritmo de filtração glomerular (RFG) estimado por equações baseadas na medida da creatinina sérica (SCr). Tal fato é de grande relevância clínica, já que estudos recentes demonstraram que a presença de doença renal crônica reduz a sobrevida e piora a resposta ao tratamento dos pacientes com câncer. Novos marcadores do RFG foram desenvolvidos nos últimos anos, visando corrigir as limitações da SCr, tais como interferência da massa muscular, ingestão proteica, idade e gênero. O objetivo desse projeto é avaliar os efeitos da quimioterapia nos novos biomarcadores de filtração glomerular cistatina C, beta-2-microglobulina e beta-traço-proteína. Será realizado estudo de coorte prospectivo, com amostra de 500 pacientes com programação de iniciar quimioterapia não hormonal para tratamento de tumor maligno sólido ou hematológico no Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP). Os pacientes realizarão coleta de sangue e urina para análise dos marcadores antes, durante e após o término da quimioterapia. Serão excluídos pacientes com idade inferior a 18 anos, pacientes sem diagnóstico confirmado de câncer, em programa regular de diálise, mulheres gestantes ou em lactação, pacientes que tenham recebido quimioterapia nos últimos 90 dias, pacientes que recebam quimioterapia exclusivamente hormonal, pacientes com internação hospitalar nos últimos 15 dias. (AU)

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O presente projeto tem por objetivo avaliar o potencial farmacológico da flavona crisina, um flavonoide encontrado naturalmente em mel, própolis e várias espécies de plantas, como o maracujá do mato (Passiflora coerulea), frente a modelos experimentais que mimetizem alguns dos principais distúrbios gastrintestinais que acometem a população humana, tais como úlcera péptica e mucosite intestinal induzida por quimioterápico. Para tanto, serão realizados modelos agudos e subagudos, em roedores, de úlcera péptica induzida por droga antiinflamatória não-esteroidal (DAINE), etanol absoluto, isquemia e reperfusão e polifarmácia, além de indução de mucosite intestinal pelo quimioterápico 5- Fluorouracil (5-FU). Serão analisados parâmetros macroscópicos (área de lesão), bioquímicos antioxidantes (superóxido dismutase, glutationa reduzida, catalase, peroxidação lipídica), anti-inflamatórios (mieloperoxidase, TNF-±, e IL-10). Nos experimentos acima descritos, serão obtidos também parâmetros para análise de possíveis efeitos tóxicos do uso contínuo da crisina através da evolução do peso corporal, letalidade, análises macroscópicas dos órgãos e bioquímicos do sangue e plasma. Os resultados obtidos fornecerão dados sobre os mecanismos de ação envolvidos em cada atividade farmacológica dessa flavona além de subsídios científicos para a futura incorporação deste composto como opção terapêutica em doenças prevalentes do trato gastrintestinal (ulcera péptica e mucosite intestinal). (AU)

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No Brasil, a leishmaniose visceral (LV) é causada pelo protozoário Leishmania infantum, cuja patologia apresenta-se de modo disseminado, crônico e potencialmente fatal. Entretanto, um fato interessante na LV é que a maioria dos indivíduos infectados permanecem assintomáticos. Sabe-se que fatores inerentes ao hospedeiro e ao parasito contribuem para o desenvolvimento da doença, mas quais e como esses fatores controlam a evolução da infecção para formas assintomáticas, brandas ou graves permanecem pouco elucidados. Diante disso, acreditamos que uma análise molecular comparativa de leucócitos de pacientes com a doença ativa, tratados (curados), assintomáticos e indivíduos saudáveis, bem como do genoma do parasito isolado de pacientes com formas brandas ou graves, refratários ou não ao tratamento convencional fornecerá dados e insights para elucidar os mecanismos da interação parasito/hospedeiro que permeiam as diferentes consequências da infecção. Assim, esse projeto tem por objetivo desenvolver uma análise molecular integrada da LV por meio da genômica funcional (RNA-seq) do hospedeiro e da genômica estrutural e comparativa do parasito (WGS, whole-genome sequencing), ambas confluindo para integração de dados que sejam úteis como novos alvos terapêuticos e de drogas. Nossos resultados preliminares de RNA-seq de leucócitos de pacientes com LV e de WGS de isolados clínicos de L. infantum mostram que esta proposta além de inovadora é altamente promissora. Por meio de análise de RNA-seq de leucócitos de sangue de pacientes com a LV antes e após o tratamento, indivíduos assintomáticos e indivíduos saudáveis identificaremos assinaturas transcricionais (genes e RNAs não codificantes) relacionadas à imunopatogênese da LV. O dual RNA-seq permitirá identificar transcritos de Leishmania a partir do transcriptoma dessas amostras. Para complementar esse perfil de assinaturas transcricionais do hospedeiro, também pretendemos desenvolver uma metodologia de estimulação antigênica de sangue total para análise de RNA-seq. A genômica estrutural de mais isolados clínicos por WGS identificará a ploidia e somia cromossômica, bem como as variantes genéticas (CNVs e SNPs). Na análise de genômica comparativa identificaremos genes e/ou regiões genômicas de L. infantum associadas à gravidade da doença e à resistência aos quimioterápicos convencionais; essa análise também fornecerá grande contribuição para a biologia das linhagens brasileiras do parasito. Por fim, em consonância com o propósito da modalidade JP/FAPESP, este projeto visa estabelecer uma nova linha de pesquisa no Departamento de Genética e Evolução (DGE) do CCBS/UFSCar, completamente inédita, já que nenhuma das linhas de pesquisa do DGE estuda qualquer aspecto das leishmanioses. (AU)

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