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Resumo

Os compostos inorgânicos presentes nos organismos vivos são formados por um mecanismo complexo (biomineralização) que envolve etapas de nucleação e crescimento em meio confinado. A necessidade de se desenvolverem novos materiais de reparo ósseo tem conduzido estudos relacionados à biomineralização. O osso é um material híbrido formado por cristais de hidroxiapatita não estequiométrica com morfologia de placas (Hap) e fibrilas de colágeno. A matriz de colágeno desempenha papel fundamental na formação da Hap óssea atuando como meio confinado para o crescimento dos cristais, que por sua vez crescem paralelos ao longo do eixo das fibrilas de colágeno. As substituições de PO43- na estrutura cristalina da Hap é outro efeito responsável pelas propriedades físico-químicas to tecido ósseo, tais como sua natureza pouco cristalina. A substituição de cátions também é observada nesta estrutura. Uma substituição comum é a de Ca2+ por Sr2+ devido às semelhanças nas razões carga/raio. Como conseqüência, Sr, um elemento traço no corpo humano amplamente disponível no solo e na água potável, se acumula preferencialmente no esqueleto. O fato deste elemento ser encontrado principalmente nos ossos tem conduzido vários estudos visando-se à compreensão de seu papel biológico na formação deste tecido e consequentemente sua aplicação em sistemas osteoindutores. Além disso, recentemente, foi demonstrado que não só o metabolismo celular, mas também as propriedades mecânicas do tecido ósseo são afetadas por fármacos anti-osteoporótico contendo Sr2+. Entretanto, poucos estudos abordaam o papel deste íon no mecanismo envolvido na mineralização óssea. Nesse sentido, propomos o uso de duas abordagens para estudar o efeito sinergístico entre colágeno e Sr2 + na formação da HAp óssea. Primeiramente, para o estudo do efeito do Sr2+ será adotada uma metodologia desenvolvida por Nassif e colaboradores na qual matrizes de colágeno foram utilizadas para precipitar uma grande variedade de apatitas. Em um segundo momento, membranas de policarbonato com tamanhos de poros controlados serão utilizadas como moldes para a síntese e estudo do mecanismo de precipitação de Hap. Será avaliada a influência das diferentes concentrações de Sr2 +, a presença de uma matriz orgânica e o efeito do confinamento nas propriedades físico-químicas da Hap. Esses materiais serão caracterizados por diversas técnicas que permitem uma investigação em nanoescala tais como espectroscopia de perda de energia de elétrons (EELS), microscopia eletrônica de transmissão criogênica, ressonância magnética de estado sólido, difração de elétrons e espectroscopia Raman. (AU)

Resumo

Levando em consideração o processo de produção de etanol a partir de biomassas lignocelulósicas (bioetanol de segunda geração), microrganismos naturalmente capazes de converter pentoses em etanol são desejados, uma vez que fermentações com cepas selvagens são mais simples e mais baratas que fermentações com cepas transformadas. Nesse cenário, duas leveduras não-convencionais têm potencial para serem aplicadas na produção de etanol a partir de hidrolisados ricos em pentoses: Scheffersomyces stipitis e Spathaspora passalidarum.Embora ambas as leveduras sejam capazes de fermentar pentoses, elas têm diferentes metabolismos quando submetidas às mesmas condições. Enquanto que S. stipitis requere uma condição de microaerofilia precisamente controlada durante a fermentação da xilose, deixando o processo tecnicamente difícil e caro, trabalhos recentes na literatura reportaram que S. passalidarum teve alto rendimento em produção etanol, rápido crescimento celular e rápido consumo de substrato em condições estritamente anaeróbicas. Embora S. passalidarum forneça alto rendimento em produção de etanol a partir de xilose em anaerobiose, é reportado que a presença de glicose interfere em seu metabolismo, demandando microaerofilia. Em usinas de etanol de primeira geração (a partir de caldo de cana-de-açúcar), a transferência de oxigênio nunca foi precisamente controlada para entender o real benefício dessa variável. Nesse contexto, a capacidade de converter xilose em etanol em condições anaeróbicas se torna um diferencial na escolha de um microrganismo para um processo de produção de etanol custo-eficiente.Uma estratégia para investigar as diferenças citadas entre S. stipitis e S. passalidarum é a aplicação da Análise de Fluxos Metabólicos com Carbono Marcado (13C-MFA), onde isótopos de carbono são usados para traçar o metabolismo celular. Essa tecnologia tem sido continuamente desenvolvida e amplamente aplicada para investigar o metabolismo celular e quantificar a distribuição do fluxo de carbono, sendo uma ferramenta valiosa para prover leituras rigorosas e quantitativas de comportamentos metabólicos em escala de rede in vivo. A Análise de Fluxos Metabólicos tem sido extensivamente aplicada, incluindo a quantificação de fluxos metabólicos, em leveduras consumidoras de glicose e, mais recentemente, em leveduras capazes de utilizar xilose, bem como em S. cerevisiae geneticamente modificada. Com as informações obtidas a partir dessa ferramenta, é possível criar modelos matemáticos estruturados para descrever reações bioquímicas considerando o metabolismo de fermentação de xilose que podem ser usados para otimizar a transformação de microrganismos.Em contribuição à linha de pesquisa que ocorre no Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), onde fermentações tem sido extensivamente executadas para compreender o comportamento e os parâmetros cinéticos para as leveduras S. stipitis e S. passalidarum, e à extensiva pesquisa em modelagem matemática de bioprocessos desenvolvida na Universidade de Campinas (UNICAMP), levando a avanços significativos em bioetanol lignocelulósico, esse projeto visa aplicar a ferramenta 13C-MFA durante fermentação de uma mistura de xilose/glicose em diferentes concentrações de oxigênio para ambas as leveduras, em colaboração com o Laboratório de Engenharia Metabólica e Biologia de Sistemas Aplicados, situado na Universidade Autònoma de Barcelona (UAB), onde essa ferramenta tem sido aplicada em casos similares. Através dos resultados obtidos com essa tecnologia, será possível compreender os efeitos da glicose e da concentração de oxigênio (anaerobiose e microaerofilia) no metabolismo de fermentação de xilose das leveduras S. stipitis e S. passalidarum. (AU)

Resumo

O plano de pesquisa apresentado neste pedido é uma continuação do Projeto Colaborativo (BBSRC / EMBRAPA BB / N004523 / 1). Parte do projeto foi realizada durante um projeto BEPE do candidato (FAPESP 2015 / 25881-1). Plantas de cevada foram transformadas com uma construção direcionada à superexpressão (oe) da Arabidopsis UCP1. Além disso, uma série de mutantes para a via N-End Rule foram transformadas com a construção Arabidopsis UCP1-oe. Linhagens homozigotas para os eventos transgênicos de cevada foram obtidas pelo grupo da Profª. Zoe Wilson (UoN). Em paralelo, as linhagens homozigotas para eventos transgênicos de Arabidopsis foram selecionadas em Campinas. Estas linhagens de Arabidopsis e as plantas UCP1-oe de cevada serão usadas para completar os experimentos durante a segunda BEPE.O objetivo do projeto é examinar o mecanismo pelo qual UCP1-oe reconfigura o metabolismo celular e induz a resposta hipóxia observada. Os dados já produzidos indicam que o UCP1-oe desencadeia hipoxia alterando a via N-End Rule. As próximas etapas incluirão o estudo da conexão entre UCP1 e a via N-End Rule durante o desenvolvimento da planta e como essa via contribui para a resposta ao estresse em plantas UCP1-oe. Nós demonstramos que a UCP1-oe torna as plantas de tabaco mais tolerantes a múltiplos estresses e aumenta a produtividade. O desenvolvimento de flores, em particular a formação de pólen, desempenha um papel fundamental na produção de sementes de plantas, mas também é extremamente vulnerável ao estresse abiótico. Observamos que as flores das linhagens UCP1-oe atuam como fortes consumidores de fotoassimilados durante o estresse por seca, resultando em maior resistência à seca e aumento do rendimento. No entanto, ainda não compreendemos completamente o efeito da UCP1 na formação de pólen e na reprodução de plantas. Este programa de trabalho paralelo em Arabidopsis e Barley nos permitirá compreender melhor o mecanismo pelo qual a UCP1-oe produz uma ampla resposta a estresses abióticos em um sistema modelo ao lado de uma cultura importante. (AU)

Resumo

Os macrófagos são componentes essenciais da imunidade inata que contribuem para a manutenção da homeostase tecidual, defesa do hospedeiro contra infecções e participam na promoção tumoral. A plasticidade dos macrófagos é uma característica notável que permite que respondam a diferentes sinais ambientais alterando seu fenótipo para um perfil pró-inflamatório (M1) ou anti-inflamatório (M2). Em muitos tipos de câncer os macrófagos associados a tumores (TAMs), que apresentam um perfil imunossupressor, estão envolvidos com crescimento tumoral, metástase, evasão imunológica e resistência à quimioterapia. Por isso, a identificação de moléculas alvos chaves para a regulação da diferenciação de macrófagos TAMs é um passo importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas contra diversos tipos de câncer. Estudos recentes têm identificado uma fina regulação do sistema imune pelo metabolismo celular. A O-GlcNAc transferase (OGT) é uma enzima responsável pela adição de UDP-GlcNAc (O-GlcNAcilação), produto final da via de biossíntese das hexosaminas (HBP), em uma série de diferentes proteínas intracelulares, regulando diversas atividades biológicas fundamentais, incluindo ativação, diferenciação e proliferação celular. A OGT é uma conhecida reguladora epigenética capaz de controlar a expressão e a estabilidade de uma série de fatores de transcrição, incluindo c-Myc. Por sua vez, c-Myc exerce um importante papel na regulação da ativação alternativa de macrófagos M2. Apesar disso, há poucos estudos sobre o efeito global da O-GlcNAcilação mediada por OGT na função imunológica de macrófagos e sua relevância clínica permanece pouco elucidado. Nossos resultados iniciais, usando camundongos knockouts para OGT em células mielóides, demonstram que a OGT é crucial para a polarização de macrófagos M2, enquanto é capaz de inibir a polarização de macrófagos M1. Dessa forma, a hipótese deste trabalho é que O-GlcNAcilação mediada pela OGT regula a expressão de c-Myc, modulando a diferenciação de macrófagos associados a tumores e consequentemente a suscetibilidade ao desenvolvimento tumoral. Assim, o presente projeto visa investigar o envolvimento de OGT em macrófagos TAMs durante o processo de imunorregulação e progressão tumoral, o que permitirá a identificação de novos alvos terapêuticos contra o câncer. (AU)

Resumo

As funções desempenhadas por macrófagos sofrem influência de fatores endógenos e exógenos que ativam ou inibem inúmeras vias de sinalização, apresentando um papel chave no elo entre as funções imunes e o metabolismo celular. O estado de ativação de macrófagos é um fator importante para o desenvolvimento de desordens metabólicas e, além disso, a presença de macrófagos em sítios distintos pode implicar em uma adaptação de suas funções para um determinado tecido. Os macrófagos residentes do tecido adiposo (ATMs) precisam adaptar suas funções frente a alterações metabólicas sistêmicas, como na obesidade. Alterações em ATMs estão correlacionadas com desenvolvimento de resistência à insulina na obesidade e aterosclerose. Os LXRs (do inglês, liver X receptors) são fatores de transcrição ativados por esteróis envolvidos no metabolismo de colesterol, altamente expressos em células imunes. Sua ativação exerce um importante papel anti-inflamatório, através da modulação positiva da expressão de citocinas anti-inflamatórias ou pela inibição de fatores de transcrição pró-inflamatórios como o NFºB. Diversos trabalhos têm atribuído aos LXRs importante papel na polarização de macrófagos (M1/M2). Contudo, a maneira pela qual LXRs modulam a função de macrófagos in vivo e como a ativação desses fatores de transcrição atua sobre o metabolismo dessas células e no desenvolvimento de resistência à insulina é pouco conhecida. Com base nisso, nossa hipótese é que a ativação de LXRs seja capaz de induzir a polarização de ATMs para um perfil M2, proporcionando uma menor inflamação no tecido adiposo, levando a melhora da sensibilidade à insulina. Desta forma, com este projeto pretendemos analisar como LXRs modulam a função e o metabolismo de ATMs e o impacto que sua deleção pode promover sobre a polarização destas células. (AU)

Resumo

O combate a doenças infecciosas vem sendo o objetivo de muitos estudos atuais já que as mesmas estão entre as principais causas de morte da população humana. Este fato ocorre, em grande parte, pelo surgimento de microrganismos multiresistentes aos antibióticos existentes no mercado, devido ao uso intensivo ou inadequado dos mesmos. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (PAMs), encontrados naturalmente em organismos vivos, são uma grande promessa para alcançar este objetivo. As toxinas intracelulares, produzidas por sistemas de morte pós-segregacional (PSK) em bactérias, tal como CcdB e ParE são exemplos recentes dessa estratégia. Estas toxinas possuem efeito inibitório frente a um grupo de enzimas que se tornaram alvos efetivos para agentes terapêuticos, denominadas DNA topoisomerases. Estas enzimas estão presentes em todas as células tanto as procarióticas quanto eucarióticas, apresentando funções essenciais à viabilidade dos micro-organismos, sendo responsáveis por catalisar, no DNA, mudanças topológicas imprescindíveis para o metabolismo celular. No entanto, os sistemas PSK são geralmente constituídos por uma toxina e uma antitoxina que possui a função de neutralizar a ação da toxina. Em um desses sistemas bastante estudado, o CcdB atua como toxina e o CcdA como antitoxina. Conforme o avanço nas descobertas de novas moléculas peptídicas biologicamente ativas existe também uma maior necessidade no estudo funcional e estrutural dessas moléculas para melhor compreensão do seu efetivo mecanismo de atuação biológica no metabolismo celular. Pretendemos, portanto, realizar estudos de interação envolvendo moléculas peptídicas do par toxina/antitoxina (CcdB/CcdA) com o objetivo de produzir um sistema com maior eficiência no combate de micro-organismos de interesse na área de saúde humana e animal. Com isso, poderemos propor um novo grupo de molécula com potencial terapêutico promissor para propósitos médicos, o que tem sido demonstrado ser uma tendência mundial no campo de desenvolvimento de novos fármacos. (AU)

Resumo

As catepsinas são enzimas que participam do processo de reabsorção óssea pela degradação proteolítica dos componentes da matriz e que, em desordem, levam ao desenvolvimento de algumas doenças como osteoporose, periodontite, periodontite apical (lesão periapical), entre outras. Neste contexto, sabe-se que o uso de inibidores de catepsinas, conhecidos como cistatinas, levam ao controle da reabsorção óssea. As fitocistatinas são uma classe de cistatinas específicas obtidas a partir de plantas, como é o caso da Citrus CPI-2, derivada da citrus. Resultados preliminares do nosso grupo de pesquisa mostraram que a Citrus CPI-2 foi capaz de inibir a atividade enzimática de catepsinas humanas e apresentou potencial anti-inflamatório. Além disso, a Citrus CPI-2 apresentou potencial para induzir a diferenciação de células indiferenciadas em fenótipo osteo/odontogênico, indicando seu potencial uso na modulação do metabolismo celular. Diante do exposto, o objetivo do projeto é estudar o efeito da fitocistatina Citrus CPI-2 sobre a proliferação, migração, diferenciação e mineralização de células de cultura primária da papila apical e da polpa dental humanas. Se for confirmado que a Citrus CPI-2 estimula a diferenciação osteo/odontogênica das células da polpa e da papila apical, ensaios adicionais serão realizados, buscando conhecer o envolvimento da via BMP/SMAD neste processo. Serão empregadas diferentes abordagens metodológicas, como ensaios de proliferação e migração celular, análise de expressão gênica por qPCR, análise de expressão proteica por immunobloting, atividade da fosfatase alcalina e coloração de vermelho de alizarina para detecção de precipitados inorgânicos. Se a hipótese de que a CitrusCPI-2 induz a diferenciação osteo/odontogênica de células da polpa dental e da papila apical for confirmada, esta poderá ser sugerida como uma promissora molécula para aplicações biotecnológicas, sobretudo para proteção pulpar direta e em técnicas de regeneração endodôntica ou, ainda, como componente de medição intracanal para favorecer o reparo/regeneração pulpar e periapical. Além disso, outros potenciais aplicações decorrem em níveis sistêmicos, como no caso de patologias ósseas que acometem todo o esqueleto. (AU)

Resumo

A molécula de glicose, comumente encontrada em meios de cultivo industriais e laboratoriais, é usada por leveduras de duas maneiras: como fonte de carbono e como fonte de energia. Saccharomyces cerevisiae, o microrganismo mais empregado na indústria biotecnológica, possui duas formas de metabolismo energético: fermentação e respiração, que permitem às células realizar a conservação da energia de Gibbs a partir da oxidação da glicose. Esta energia é temporariamente armazenada nas ligações químicas da molécula de trifosfato de adenosina (ATP), apresentando um saldo de 2 ATP/glicose no metabolismo puramente fermentativo e em torno de 30 ATP/glicose no metabolismo exclusivamente respiratório. Porém, através de análises termodinâmicas, observa-se que grande parcela da energia de Gibbs envolvida nas diferentes reações metabólicas da fermentação e da respiração não resulta na síntese de ATP. Além disto, a conversão de glicose em biomassa, que é tipicamente em torno de 0,1 gramas de massa seca de células por grama de glicose (g MSC/g GLC) no metabolismo fermentativo e em torno de 0,5 g MSC/g GLC no metabolismo respiratório, não é condizente com o respectivo saldo energético. Assim, existe uma dúvida sobre se essa energia é dissipada ou se a célula a armazena de outras formas, por exemplo em outros compostos que fazem parte da biomassa celular. Neste trabalho visamos testar a hipótese de que a célula armazene ao menos parte dessa energia sobressalente na forma de ligações químicas em compostos como proteínas, lipídeos e/ou outras moléculas que compõem a própria célula. Dessa forma, analisaremos a composição celular da levedura Saccharomyces cerevisiae em duas situações diferentes, sendo uma em células com metabolismo puramente fermentativo e outra em células com metabolismo puramente respiratório. Assim, verificaremos se há um maior conteúdo energético em células que crescem com metabolismo respiratório, em relação a células que crescem com metabolismo fermentativo. (AU)

Valor preditivo de ploidia de DNA combinada a marcardores de transformação maligna em lesles orais cancerizáveis

Processo:17/06579-1
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de setembro de 2017 - 31 de agosto de 2019
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Odontologia
Pesquisador responsável:Marcelo Sperandio
Beneficiário:
Instituição-sede: Sociedade Regional de Ensino e Saúde Ltda. Faculdade São Leopoldo Mandic (SLMANDIC). Centro de Pesquisas Odontológicas São Leopoldo Mandic
Pesq. associados:

Andresa Borges Soares ; Vera Cavalcanti de Araujo

Assunto(s):Transformação celular neoplásicaNeoplasias bucaisAneuploidiaAutofagiaCiclo celularMetabolismo celularCitometria de fluxo
Resumo

O carcinoma espinocelular oral (CEO) está entre os tipos mais comuns de câncer no mundo, com aproximadamente 600.000 novos casos por ano acompanhados de 120.000 mortes e sobrevida de 5 anos de aproximadamente 50%. O diagnóstico e tratamento precoces são os fatores de maior impacto na sobrevida e qualidade de vida destes pacientes. A maioria dos CEO é precedida por alterações assintomáticas, detectadas em mucosa oral, chamadas de lesões potencialmente malignas (DPM). Não existe uma característica clínica ou microscópica patognomônica capaz de prever transformação maligna. Sugere-se, na proposta deste trabalho, que marcadores diversos de processos biológicos relacionados à tumorigênese, tais como aneuploidia, alterações do ciclo celular, autofagia, bem como alterações metabólicas possam ter maior valor prognóstico do que marcadores isolados ou aqueles associados a um único processo biológico. Assim, os objetivos deste trabalho serão: 1) Fazer um levantamento de lesões cancerizáveis da boca de acordo com seu grau de displasia epitelial e identificar os casos que sofreram transformação maligna; 2) Avaliar a ploidia de DNA das lesões identificadas e sua correlação com a expressão de proteínas envolvidas no processo de tumorigênese, tais como ciclina D1, Glut-1, galectina 3, LC3B e Beclin-1; 3) Calcular os valores preditivos de transformação maligna, sensibilidade e especificidade de cada um dos marcadores bem como de combinações de marcadores. Serão utilizados os casos do arquivo de biópsias preservadas em parafina da São Leopoldo Mandic. As lâminas de cada caso serão revistas quanto ao diagnóstico do grau de displasia epitelial e divididas em 6 grupos (N=240, n=40): leucoplasias sem displasia, leucoplasias com displasia leve, leucoplasias com displasia moderada, leucoplasias com displasia severa, carcinoma in situ (controle positivo) e hiperplasias fibrosas inflamatórias (controle negativo). A determinação da ploidia de DNA será realizada através de suspensões de núcleos epiteliais obtidos por digestão enzimática, corados com iodeto de propídio e analisados por citometria de fluxo. Os biomarcadores ciclina D1, Glut-1, galectina 3, LC3B e Beclin-1 serão investigados por imunohistoquímica. Os dados da ploidia e dos demais biomarcadores serão analisados descritivamente e estatisticamente pelo teste de sobrevivência de Kaplan-Meier tanto para cada marcador individual como para combinações de marcadores. Espera-se com os resultados obtidos desenhar uma matriz diagnóstica e prognóstica destas lesões capaz de prever transformação maligna de lesões da mucosa oral com alta sensibilidade e especificidade. (AU)

Resumo

A doença renal crônica é uma das principais enfermidades que acometem os felinos. A doença pode acometer gatos de todas as idades, mas o mais comumente visto são gatos de meia idade a idosos. Os tratamentos são direcionados ao manejo das complicações implicadas pela doença, desacelerando sua progressão, deve ser feito o apropriado tratamento suporte para melhorar a qualidade e prolongar a vida do paciente. As terapias celulares foram propostas a fim de trazer alternativas aos tratamentos paliativos já preconizados. Para a realização deste estudo, serão utilizados rins de gatos adultos com DCR o qual vieram a óbito e foram doados pelos tutores dos animais e estes serão analisados macroscopicamente, através de microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, quanto a caracterização celular, teste de criopreservação e viabilidade celular pelo método de azul de tripan, imunocitoquímica e metabolismo celular pelo método MTT. A falta de modelos in vitro para estudos da doença renal crônica impedem testes de novos medicamentos e um estudo aprofundado da doença em nível celular. Portanto este projeto visa, por meio de cultivo celular de células de metanefro de gatos com doença renal crônica, estabelecer um novo modelo celular para futuros estudos com esta doença, possibilitando a realização de um cultivo celular que dará apoio no tratamento de doença renal crônica e consequentemente no bem-estar animal. (AU)

Resumo

A compreensão dos mecanismos da gênese da obesidade, bem como a capacidade de reversão do fenótipo obeso, é de extrema importância para a prevenção e combate desta patologia e suas comorbidades. O hipotálamo, localizado no sistema nervoso central, coordena a homeostase energética, através da atuação de duas populações neuronais com funções antagônicas. O consumo de dietas ricas em gorduras saturadas promove inflamação hipotalâmica e prejudica a sinalização anorexigênica, que possui como efetores funcionais os clivados do peptídeo POMC. Sabe-se que a disfunção dos neurônios anorexigênicos (neurônios que expressam POMC) ocorre devido a instalação do processo inflamatório e em dois níveis distintos: numérico (morte celular) e funcional. Os peptídeos clivados de POMC, além de seu papel na homeostase energética, apresentam conhecidos papéis anti-inflamatórios. Nenhum trabalho até então explorou o impacto da disfunção de tais peptídeos na inflamação hipotalâmica. Nossa hipótese é que a disfunção de neurônios POMC é um dos eventos necessários para a perpetuação e intensificação do sinal inflamatório no hipotálamo, uma vez que haverá diminuição dos níveis teciduais de ±-MSH, um dos peptídeos clivados a partir de POMC. Nossos objetivos são explorar a capacidade anti-inflamatória do ±-MSH na linhagem celular de micróglia e in vivo em um contexto obesogênico. Serão avaliados a capacidade de indução da expressão de citocinas, bem como a reprogramação metabólica das células imunes. Esperamos que o tratamento in vitro com o análogo sintético de ±-MSH seja capaz de induzir um perfil anti-inflamatório na micróglia, e que essa alteração seja acompanhada de uma mudança de seu metabolismo celular. Acreditamos ainda, que em um contexto obesogênico (tratamento com palmitato), o tratamento com o análogo sintético será capaz de reverter, ou pelo menos atuar, o tônus inflamatório. Esperamos que, in vivo, possamos estabelecer correlações entre os níveis teciduais de ±-MSH e o perfil inflamatório no hipotálamo. (AU)

Resumo

A estabilidade do genoma é comprometida por diversos agentes agressores capazes de alterar a estrutura da molécula de DNA. Essas lesões bloqueiam polimerases replicativas e transcricionais podendo culminar em morte celular ou mutagênese. No entanto, a fim de revertê-las, a evolução lapidou sistemas de reparo de DNA, sendo o Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) um deles. As lesões resolvidas por essa via são causadas principalmente pela luz ultravioleta (UV) da luz solar, conhecidas como fotoprodutos. Contudo, especula-se que NER também esteja envolvido na resolução de lesões causadas por agentes oxidantes, e principalmente, dos produtos reativos do metabolismo celular, os quais podem levar ao estresse oxidativo. Deficiências em NER podem resultar em síndromes humanas associadas à alta predisposição a câncer de pele, mas também a anormalidades do neurodesenvolvimento, neurodegeneração e/ou envelhecimento precoce. Enquanto os mecanismos de predisposição ao câncer de pele associados ao NER são relativamente bem compreendidos como consequência de fotoprodutos não reparados, as causas das anormalidades neurológicas ainda não foram elucidadas. A Síndrome de Cockayne (CS) é causada por deficiência em NER e caracterizada por neurodegeneração, progeria segmentada, falha de crescimento e fotossensibilidade, mas os pacientes não são propensos ao câncer. Nossos dados preliminares, utilizando a tecnologia de reprogramação celular, mostraram que existe aumento na sensibilidade ao estresse oxidativo em células pluripotentes induzidas (iPSC) e progenitoras neurais (NPC) de pacientes CS quando comparadas aos fibroblastos primários isogênicos dos quais foram originadas. Estes resultados indicam que as anormalidades neurológicas dos pacientes com CS podem ser devido à sensibilidade do tecido neural ao estresse oxidativo. Este projeto visa entender as respostas de células tronco pluripotentes induzidas (iPSC), células progenitoras neurais (NPC) e neurônios provenientes de pacientes CS frente a diferentes condições de estresse oxidativo, e tensões de oxigênio, em relação a células proficientes em reparo. Pretendemos avaliar, além de sensibilidade em si, também a formação, e eventual reparo, de lesões induzidas no DNA dessas células. Os efeitos de diferentes condições de estresse oxidativo no processo de diferenciação das células NPC em neurônios funcionais também deverá ser investigado. É nossa expectativa que os resultados obtidos permitirão uma melhor compreensão do fenótipo clínico degenerativo de pacientes CS e sua relação com lesões no DNA celular. (AU)

Resumo

A Obesidade pode ser descrita como a "nova síndrome mundial", caracterizada por uma inflamação crônica de baixo grau que é devida principalmente à endotoxemia sistêmica, o que ocorre em consequência de um aumento da permeabilidade intestinal devido a alterações da microbiota intestinal e, consequentemente, extravasamento de endotoxinas, tais como lipopolissacarídeo (LPS) para a circulação. Além disso, na Obesidade, são descritas diferenças entre o metabolismo das células imunes. Importantemente, na Obesidade observa-se um aumento do infiltrado de macrófagos CX3CR1+ na lâmina própria intestinal. Células CX3CR1+ da lâmina própria representam um grupo heterogêneo de células, que expressam níveis altos, baixos e intermediários de CX3CR1 juntamente com F4/80 e CD11b. No ambiente intestinal, o metabolismo basal é diferente de outros tecidos. Os níveis basais de O2 são excepcionalmente baixos devido ao fluxo de sangue em contra-corrente, à presença de bactérias e de muco. Sabendo que os macrófagos residentes CX3CR1+ da lâmina própria estão sobrevivendo nesse microambiente hipóxico, diferentes necessidades de energia podem ser requeridas, comparados a macrófagos residentes de outros tecidos. Assim, a identificação de mecanismos que são moduladores do metabolismo desses macrófagos pode facilitar a compreensão dos processos inflamatórios no intestino durante a alimentação com uma dieta rica com lipídeos (HFD), e consequente desenvolvimento da Obesidade. A obesidade está correlacionada com alterações na microbiota intestinal, secreção aumentada de metabólitos microbianos e absorção de nutrientes, aumento da permeabilidade intestinal, e níveis elevados de LPS circulantes. A função dos macrófagos está intimamente ligada a mudanças intrínsecas no metabolismo celular. Macrófagos da lâmina própria estão na interface entre a fisiologia intestinal e biologia sistêmica, e a nossa hipótese é de que, sob HFD, alterações no metabolismo dos macrófagos CX3CR1+ da lâmina própria leva a perda de integridade da barreira intestinal, e, portanto, a indução da inflamação sistêmica que é crítica para o desenvolvimento da Obesidade, inflamação crônica relacionada e resistência à insulina. (AU)

Resumo

A melatonina, hormônio responsável por carrear as informações fotoperiódicas ao organismo, transmite dados sobre as variações na intensidade de luz que ocorre durante os dias e noites ao longo do ano, permitindo ao organismo responder com mudanças adaptativas às alterações do meio ambiente. Regula ainda várias funções celulares, como modulação da imunidade tipo humorais e da medida por células, controle do metabolismo de glicose e insulina no tecido adiposo, atuação sobre a atividade neuronal no hipocampo, ação sobre o tônus vascular, regulação da função reprodutiva em mamíferos. Em humanos, pesquisadores mostraram que a melatonina está mais de três vezes aumentada no líquido folicular do que na circulação sanguínea, o que sugere a influência deste hormônio na maturação folicular. Além disso, as células da granulosa de ovários de ratas expressam os receptores de melatonina do tipo I e II e ação dependente dos níveis de estrogênio no meio de cultura, podendo ter uma ação estimulatória ou inibidora sobre o AMP cíclico, modulando o metabolismo intracelular. Contudo, pouco se sabe sobre sua ação sobre as células da granulosa em mulheres com infertilidade principalmente os mecanismos moleculares envolvidos. Por esta razão, estamos realizando este estudo para avaliar as vias de ação da melatonina sobre as células da granulosa dos ovários de mulheres com infertilidade por estudos de biologia molecular envolvendo diversas vias de sinalização como a angiogênese. (AU)

Resumo

O tratamento atual da doença de Pompe, pertencente a classe dos distúrbios de depósito lisossômico, é realizado por terapia de reposição enzimática utilizando a glicoproteína recombinante humana alfa-Glicosidase ácida, produzida em células de ovário de hamster chinês (CHO). Apesar dos resultados satisfatórios, casos de reações imunológicas graves têm sido reportados devido as diferenças entre a proteína recombinante e a nativa do organismo. Há um crescente entusiasmo em relação ao uso de linhagens celulares humanas como plataforma para produção de glicoproteínas recombinantes, por conta de sua capacidade de produzir glicoproteínas o mais próximo possível àquelas encontradas naturalmente no corpo humano, minimizando as possíveis reações imunogênicas. Frente ao exposto o presente trabalho tem como objetivo avaliar o potencial de produção da glicoproteína recombinante humana ±-Glicosidase ácida pela linhagem celular humana HKB-11. Para isto, as células HKB-11 serão geneticamente modificadas e cultivadas em meio livre de soro fetal bovino e em suspensão, condições compatíveis com a escala industrial. Após a modificação gênica será caracterizada a cinética de crescimento e o metabolismo celular bem como a cinética de produção da enzima. Espera-se com este trabalho, avaliar a possibilidade de estabelecimento de uma plataforma alternativa de produção desta enzima, capaz de gerar um produtor com menor imunogenicidade. (AU)

Resumo

O uso de nanopartículas compreende aplicações promissoras na medicina. Destacam-se as Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) por serem produzidas com componentes biodegradáveis e biocompatíveis. Diversos estudos demonstram que essas nanopartículas são internalizadas pelas células, são processadas e muito tem-se estudado sobre seus efeitos terapêuticos, mas pouco se sabe sobre seus efeitos em vias de sinalização intracelular. O estudo da endocitose associado à sinalização se faz necessário para melhor entender os impactos dessas nanopartículas em células eucarióticas. Resultados prévios de nosso laboratório mostram uma correlação entre internalização de NLS e a translocação de Smad2/3 fosforilada para o núcleo de células de câncer de próstata (PC-3). A Smad2/3 fosforilada é relacionada com a ativação da via de sinalização do TGF-Beta. Essa via está relacionada com estágios avançados do câncer, aumentando a migração e invasão celular quando desregulada. A presente proposta pretende avaliar os efeitos da transfecção por NLS na via de sinalização do TGF-Beta, observando quais são as consequências para o metabolismo celular de células normais de próstata PNT2 e células de câncer de próstata PC-3 na possível ativação da via do TGF-Beta. (AU)

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O tumor de sítio primário desconhecido (CUP) caracteriza-se pela ocorrência de metástases associada à ausência de reconhecimento do local de origem. Representa um grupo heterogêneo, em geral, pouco responsivo à quimioterapia citotóxica convencional, com uma sobrevida global de 3 - 6 meses após o diagnóstico. As alterações metabólicas nas células cancerígenas permitem a proliferação e crescimentos celulares de modo singular, independentemente da oferta ou ausência de O2 (Efeito Warburg). Desta forma, a caracterização do perfil metabólico do CUP pode impulsionar a busca por evidências do papel das proteínas envolvidas na reprogramação do metabolismo como marcadores tumorais, assim como potenciais alvos terapêuticos. Objetivo: O presente projeto de pesquisa tem como objetivo caracterizar a expressão do MCT1 e MCT2 em tumores de sítio primário desconhecido e associar estes achados aos dados clinico-patológicos dos pacientes diagnosticados com CUP. Materiais e métodos: A expressão do MCT1 e MCT2 será analisada por imunohistoquímica, em uma série de cerca de 120 CUPs. A graduação final será dada pela soma dos parâmetros extensão e intensidade. Por fim, os achados serão associados aos dados clínicos e patológicos dos pacientes diagnosticados com CUP, utilizando o SPSS. (AU)

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O estudo da lógica da expressão gênica em bactérias luz da Biologia Sintética é muito dependente do uso de linhagens bacterianas mutantes para fatores de transcrição específicos de forma a facilitar a caracterização de cada componente do circuito isoladamente. Além disso, a análise de atividade promotora feita in vivo é normalmente feita através de genes repórteres fluorescentes (como o GFP) inseridos em plasmídeos. Entretanto, esses sistemas podem causar variações celulares, seja por diferença de número de plasmídeos por célula ou por sobrecarga do metabolismo celular, que podem influenciar na análise da expressão gênica. Nós já caracterizamos a ausência de efeitos pleiotrópicos na expressão gênica de GFP regulada por Promotores Constitutivos Sintéticos inserida por plasmídeos de baixo número de cópias em bactérias mutantes para Fatores de Transcrição Globais (CRP, IHF e Fis). Nesse projeto, prpõe-se a implementação de um sistema repórter mono cópia estável para integração no cromossomo a fim de se caracterizar a atividade promotora em Escherichia coli. Será testado também novos promotores sintéticos regulados por CRP e Fis de uma biblioteca de promotores em mono cópia usando a integração cromossomal. Esses sistemas de inserção serão feitos usando-se Transposons Vectors, amplamente descritos pelo Environmental Microbiology Laboratory, onde esse projeto será desenvolvido. O sistema desenvolvido no projeto proporcionará uma nova metodologia que será implementada posteriormente em Ribeirão Preto com um importante impacto em projetos do grupo. (AU)

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Os linfócitos T reguladores (Tregs) são células essenciais na homeostase do sistema imune. Diferentemente dos linfócitos T helpers (Ths), que estão envolvidos na resposta efetora da imunidade adaptativa, as Tregs atuam na supressão das atividades potencialmente deletérias dos linfócitos Ths, por intermédio de diversas atividades supressoras. O principal estímulo de diferenciação de Tregs na periferia é a citocina TGF-²1,2. O TGF-² liga-se a um receptor de membrana e desencadeia uma resposta intracelular que culmina na fosforilação e, consequente, ativação das proteínas Smad2 e Smad3. As proteínas Smads são Fatores de Transcrição (FT) importados para o núcleo que, atuando em sinergia com outros FTs, promovem a diferenciação de linfócitos T "naives" em Tregs por promover a expressão do Foxp3, que é o principal FT destas células3. Além da via de Smads, TGF-² também ativa diversas outras vias, que variam dependendo do tipo celular2. A amplitude e a duração do estímulo de TGF-² são limitados pela ubiquitinação de Smad2 e Smad3 pela ubiquitina ligase NEDD4L, que marca seletivamente essas proteínas para destruição, alterando seu tempo de meia vida e de turn over4,5. Em nosso laboratório, foi demonstrado que a ativação de linfócitos por TGF-² ativa a via metabólica das hexosaminas, com a consequente produção do açúcar modificado UDP-GlcNAc, o qual é utilizado como substrato para a O-GlcNAcilação de proteínas pela enzima OGT (uridina-difosfo-N-acetilglicosamina:polipeptideo-²-N-acetilglicosaminiltransferase ou O-GlcNActransferase) (manuscrito em preparação). A enzima OGT modifica pós-traducionalmente o esqueleto de proteínas-alvo citoplasmáticas e nucleares, pela adição de UDP-GlcNAc em resíduos de serina e treonina. Dessa forma, a GlcNAcilação modifica e, portanto, regula funções de proteínas de maneira análoga ou competindo com o processo de fosforilação. Nesse contexto, nós identificamos que o TGF-² promove a O-GlcNAcilação de NEDD4L nas Tregs durante sua diferenciação e que o bloqueio da O-GlcNAcilação através da inibição da OGT reduz a diferenciação destas células. Assim, considerando a relevância de NEDD4L na regulação negativa da sinalização do TGF-², nossa hipótese é de que a O-GlcNAcilação da NEDD4L induzida por TGF-² seja um processo crítico para a diferenciação e estabilidade das Tregs. Desta forma, o presente projeto propõe investigar a função da NEDD4L, bem como avaliar a importância da O-GlcNAcilação desta proteína, na diferenciação das Tregs. (AU)

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O NAADP (ácido nicotínico adenina dinucleótido fosfato) foi proposto como um segundo mensageiro para o glutamato em células neuronais e gliais através da ativação dos canais lisossômicos de Ca2+, TPC1 e TPC2. Entretanto, as ações do glutamato mediadas pelo NAADP permanecem obscuras. Neste estudo, avaliamos o efeito do glutamato na autofagia em astrócitos em concentrações fisiológicas não tóxicas. Descobrimos que o glutamato induz a autofagia semelhante àquela induzida pelo NAADP. No entanto, a inibição dos receptores TPC1 ou TPC2, pelo antagonista desses receptores, NED-19 ou pelo SiRNA, diminui a autofagia induzida por glutamato, confirmando um papel para a NAADP nesta via. O envolvimento de TPC1/2 na autofagia induzida por glutamato também foi confirmado em células de neuroblastoma SHSY5Y. Finalmente, mostramos que o glutamato ativa a autofagia dependente de NAADP via AMPK, enquanto a atividade de mTOR não é afetada por este tratamento. Em resumo, os nossos resultados indicam que o glutamato estimula a autofagia através do eixo NAADP/TPC/AMPK, proporcionando novos conhecimentos de como a sinalização de Ca2+ mediada pelo glutamato pode controlar o metabolismo celular no sistema nervoso central. (AU)

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Sepse é uma síndrome complexa induzida por microrganismos na qual o hospedeiro sofre com disfunções fisiológicas, imunológicas e bioquímicas, levando-o a um quadro grave e de alta taxa de mortalidade (30% a 60%) (CHAARI et al., 2016; DELLINGER et al., 2013; SINGER et al., 2016). A patofisiologia da Sepse é caracterizada pela presença de microrganismos ou seus subprodutos na corrente sanguínea e pela liberação massiva de mediadores inflamatórios pelas células imunes. A combinação desses dois fatores ativa os neutrófilos presentes na circulação que ficam presos nos órgãos vitais do hospedeiro, onde liberam, entre outros mediadores citotóxicos, as Neutrophil Extracellular Traps (NETs). A literatura demonstra que as NETs contribuem para a falência de órgãos na Sepse. NETs também estão envolvidas na lesão observada em várias outras doenças como Diabetes e Artrite (BRINKMANN et al., 2004; NAUSEEF; BORREGAARD, 2014). No contexto de Sepse, as NETs estão envolvidas no dano tecidual em vários órgãos incluindo pulmões, rins e fígado (CZAIKOSKI et al., 2016). Apesar dos mecanismos envolvendo a produção de NETs não serem bem descritos durante episódios de Sepse, há evidencias de que um evento inicial neste processo é a ativação da enzima dependente de cálcio PADI4. Recentemente, o link entre mudanças do metabolismo celular e a ativação do sistema imune tem sido consolidada (CHANG et al., 2015; HO et al., 2015; RODRÍGUEZ-ESPINOSA et al., 2015), no entanto, o envolvimento do metabolismo celular e a geração de NETs não foi bem investigado. Um estudo preliminar do nosso grupo demonstrou que diminuindo a atividade da via glicolítica resultou na diminuição da formação de NETs. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a importância do imunometabolismo para o desenvolvimento das NETs e a piora do quadro séptico. Além disso vamos investigar uma nova abordagem terapêutica para a prevenção da Sepse grave mesclando o tratamento tradicional com antibióticos com a modulação do metabolismo celular. (AU)

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Atualmente é evidenciada a necessidade de se compreender como alterações metabólicas podem contribuir para a modulação da atividade de vias de sinalização, de fatores de transcrição, e para alterações epigenéticas que favoreçam a proliferação celular, podendo ter implicações para a prevenção e tratamento do câncer.Benzo[a]pireno (B[a]P) é um carcinógeno difundido no meio ambiente, sendo utilizado em nossos estudos como indutor de transformação maligna em células epiteliais bronquiais humanas imortalizadas (BEAS-2B). No modelo de tumorigênese caracterizado no grupo observou-se que: i) as células expostas a B[a]P sofreram alterações no metabolismo intermediário logo na primeira hora de exposição, com queda inicial dos níveis de NAD+, NADH, NADPH, ATP, ADP, piruvato, lactato, succinato, malato, glutamina e glutamato, seguida pelo aumento significativo dos níveis dessas moléculas e de fumarato ao longo de 7 dias de incubação, em relação ao controle; ii) as alterações metabólicas observadas foram acompanhadas de alterações dos níveis de 5-mdC e 5-hmdC no DNA das células e aumento do crescimento de colônias em soft-agar, sem aumento da taxa de mutação no gene HPRT.Uma vez que NAD+ e NADH regulam a atividade de enzimas do metabolismo intermediário, de fatores de transcrição e a expressão de genes que codificam para proteínas envolvidas no controle do metabolismo e crescimento celular, e que fumarato e succinato são apontados como oncometabólitos, pretende-se aqui avaliar a modulação do metabolismo, de marcas epigenéticas, da expressão de alguns genes controlados pelo balanço redox NAD+/NADH, da expressão de proteínas envolvidas na alteração do metabolismo em células tumorais, e da transformação celular em células BEAS-2B suplementadas com NAD+, succinato e fumarato, na presença e ausência de B[a]P.Os dados obtidos permitirão uma melhor compreensão do papel de alterações metabólicas induzidas por xenobióticos (no caso, B[a]P) para a tumorigênese, sendo importante para a adoção de procedimentos efetivos de quimioprevenção do câncer, o que é necessário para que se diminuam os impactos sociais e econômicos desse grave conjunto de doenças que tende a crescer exponencialmente com o envelhecimento da população. (AU)

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Nos últimos 20 anos vêm ocorrendo um declínio na fertilidade das vacas leiteiras cuja etiologia é complexa. Inúmeros fatores têm sido identificados como os causadores da redução na fertilidade, entre eles distúrbios metabólicos como o balanço energético negativo (NEB). Vacas em NEB possuem as concentrações séricas dos corpos cetônicos aumentadas, cujo principal deles é o Ácido b-hidroxibutírico (BOHB), o qual aumenta em paralelo no fluido folicular e pode afetar a maturação oocitária e, consequentemente, o desenvolvimento embrionário. Entretanto, os mecanismos através dos quais os corpos cetônicos afetam a reprodução dos animais não são completamente entendidos a nível molecular. Recentemente, o BOHB foi descoberto ser um poderoso inibidor endógeno das Histonas Desacetilases (HDACs). As HDACs são enzimas que removem o radical acetil das histonas, desta forma exercem amplas funções regulatórias nas células, principalmente regulando a expressão gênica. Desta maneira, a inibição das HDACs causada pela exposição ao BOHB altera o epigenoma celular através da hiperacetilação das histonas. Uma vez que os níveis de BOHB oscilam em decorrência da alimentação do animal, esta molécula tem o potencial de agir como um elo conectando a nutrição do animal ao metabolismo celular e a regulação da expressão gênica. Entretanto, os mecanismos através dos quais a nutrição do animal pode afetar o seu epigenoma e consequentemente a reprodução são elusivos. Baseado nisso, este trabalho visa investigar como a exposição dos complexos cumulus-oócito (COCs) ao corpo cetônico BOHB durante a maturação oocitária in vitro altera o epigenoma e a população de RNAs destes, e se essas alterações afetam a maturação oocitária e o desenvolvimento embrionário in vitro. Nós esperamos com este projeto entender os mecanismos moleculares através dos quais um corpo cetônico comumente alterado em vacas leiteiras, o BOHB, pode afetar a fertilidade destes animais. (AU)

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Sepse é a principal causa de óbito em UTI e pode ser definida como uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção, o que causa disfunção orgânica. Dados recentes apontam que respostas tanto pró-inflamatórias como anti-inflamatórias ocorrem simultaneamente e desde o início do quadro séptico. E diversos estudos mostram a importância do metabolismo energético na regulação da resposta imune, que atua inclusive de forma a orientar a função e o destino celular. Diferentes células das respostas inata e adaptativa, por exemplo, quando ativadas trocam a fosforilação oxidativa pela glicólise aeróbia, fenômeno conhecido como efeito Warburg e regulado por HIF (fator de transcrição induzido por hipóxia). Dados já obtidos pelo nosso grupo apontam para alterações no metabolismo celular e mostram mudanças na expressão de proteínas de vias metabólicas no plasma de pacientes sépticos. Assim, o objetivo desse projeto é analisar como a função mitocondrial e o metabolismo celular estão alterados em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de pacientes sépticos. Será efetuada análise proteômica nas amostras de PBMC indivíduos sépticos e sadios, com foco em proteínas relacionadas ao metabolismo celular; e a validação será feita por western blotting. Para verificar se há transição do metabolismo para glicólise aeróbia serão dosados lactato e NAD+ nessas células, e também será feita análise da expressão de genes relacionados a HIF por PCR array. Esse estudo contribuirá na compreensão dos eventos celulares que regulam a imunomodulação na sepse, auxiliando na busca por terapias efetivas e novos métodos diagnósticos. (AU)

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Existem diversos tipos de tratamentos clareadores hoje em dia, associando ou não com luzes LEDs ou Laser, porém estas técnicas têm sido associado com queixas de sensibilidade pelo paciente. Com intuito de melhorar este desconforto pesquisadores tem proposto um clareamento denteário apenas a irradiação de uma fonte de luz LED violeta, sem a necessidade do gel clareador, porém restam dúvidas quanto sua eficácia e demais qualidades. Portanto será o objetivo deste trabalho avaliar este novo tratamento associado com diferentes concentrações de H2O2 quanto a sua eficácia clareadora, capacidade de penetração do H2O2 pela estrutura dentária, a citotoxicidade dos diversos protocolos, bem como a permeabilidade do esmalte e da dentina, e também avaliar a temperatura intrapulpar e a influência dos tratamentos na adesão à materiais resinosos. Para tanto inicialmente serão escolhidos 500 dentes bovinos. Em seguida estes dentes serão distribuídos para os testes a serem realizados. Depois de distribuídos, resultarão em 10 dentes para os seguintes grupos: GI-controle; GII-PH 35%; GIII-PH 17,5%; GIV-LED/Laser; GV-PH 35%+LED/Laser; GVI-PH17,5%+LED/Laser; GVII-LED violeta; GVIII-PH 35%+LED violeta; GIX-PH 17,5%+LED violeta. Os tratamentos clareadores serão realizados em 3 sessões, com 3 aplicações de 15 minutos em cada sessão, totalizando 45 minutos de contato do gel com o dente por sessão. Os grupos que receberem a irradiação com LED/Laser será feita 3 irradiações com 3 minutos cada, os grupos que receberem a irradiação com LED violeta, os espécimes serão irradiados por 20 vezes de 30s com intervalo de 1 minuto entre cada irradiação. Após os procedimentos clareadores, serão realizadas as análises de alteração cromática superficial e profunda, da intensidade de fluorescência, condutância hidráulica, capacidade de penetração do H2O2 através das estruturas dentárias, citotoxicidade, avaliando o metabolismo celular pelo teste de MTT, quantificar a variação da temperatura intrapulpar e também o teste de microtração para avaliar a capacidade de formação de tags após os tratamentos. Após a coleta dos dados, estes serão submetidos à testes estatísticos adequados para cada tipo de análise. (AU)

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O desenvolvimento de novos dispositivos para monitorar o metabolismo celular e o diagnóstico de doenças expandiu as pesquisas com biossensores, que aliados a nanotecnologia possibilitam a criação de novos elementos com alta sensibilidade de detecção, especificidade e capacidade de multiplexação em dispositivos portáteis. Desta forma, o monitoramento de produtos secretados por células e monitorados por de biossensores trás uma ampla gama de inovação nas áreas biomédicas e de saúde, pois este produtos liberados por células transmitem uma ampla variedade de sinais químicos e biológicos que são fundamentais para o diagnóstico clínico. Atualmente os estudos de biocompatibilidade e as respostas das células a estímulos físicos ou químicos podem ser avaliadas em dispositivos de microfluídicos e técnicas eletroquímicas. Aqui iremos desenvolver biossensores utilizando aptâmeros para estudar diferentes marcadores celulares liberados por células de câncer de próstata. Sendo assim, o objetivo desta proposta é desenvolver uma plataforma de um biossensor integrado para monitorar a detecção de multi-analitos (PSA, fPSA, hK2, Mucinas e fator de crescimento vascular endotelial,VEGF) em um dispositivo fabricado onde o microambiente celular pode ser definido com precisão, possibilitando a avaliação do metabolismo energético de culturas celulares no contexto da mimetização do microambiente celular e oferecendo novas perspectivas sobre os eventos moleculares do metabolismo. (AU)

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Tradicionalmente os mecanismos moleculares envolvidos no processo de tumorigênese são atribuídos à desregulação dos oncogenes e supressores de tumor que controlam vias de sinalização celular responsáveis pelo funcionamento do ciclo celular e manutenção do crescimento, proliferação e morte celular. No entanto, evidências recentes apontam para um mecanismo alternativo, em que a função primária da ativação de oncogenes e inativação de supressores de tumor é reprogramar o metabolismo celular. Esse cenário é consistente com as descobertas de que alguns metabólitos em si podem ter atividade oncogênica, alterando a sinalização e bloqueando a diferenciação celular. Estes sinais metabólicos agem desempenhando papéis críticos na determinação da estrutura da cromatina dado que são substratos necessários das enzimas modificadoras da cromatina que modificam tanto histonas quanto o DNA. Variações nestas duas vias irão determinar o remodelamento epigenético e o controle da expressão gênica. Neste projeto, vamos abordar como o metabolismo de glutamina em alfa-cetoglutarato, comandado em específico pela enzima glutaminase, afeta o remodelamento da cromatina e controle epigenético de vias importantes para a manutenção do fenótipo cancer stem cell (CSC). Embora não muito amplamente apreciado, sinais metabólicos e nutricionais (diretos ou via enzimas metabólicas) também desempenham um papel importante no controle genético da expressão pela alteração da função de fatores de transcrição. Neste projeto, vamos também abordar como uma descoberta feita pelo nosso grupo, de que a isoforma 3 do fator de transcrição induzido por hipóxia (Hypoxia-Inducible Factor, HIF) interage diretamente com lipídeos, afeta a atividade de regulação da transcrição deste fator; outro objetivo visa identificar os detalhes moleculares e funcionais da interação indentificada por nós entre a enzima glutaminase kidney-type, KGA, e o fator de transcrição PPAR³. (AU)

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A formação da dentina é um processo complexo que envolve diversos passos de diferenciação celular, culminando com o desenvolvimento de uma matriz mineralizada muito similar à do tecido ósseo. A regeneração dentinária pode ser necessária em casos de exposição pulpar, reabsorções e lesões cariosas. A engenharia tecidual tem estudado a regeneração funcional de tecidos perdidos baseada na presença de células, arcabouços e/ou substâncias que induzem a proliferação e diferenciação celular. Entre as diversas substâncias que podem interagir com o metabolismo celular estão os extratos ricos em proantocianidina, compostos fenólicos bioativos presentes no extrato da semente de uva (GSE). Sendo assim, o objetivo deste trabalho é avaliar o potencial estimulatório do GSE na atividade funcional de células indiferenciadas da polpa assim como de células odontoblastóides. Serão utilizadas células imortalizadas da papila dentária de camundongos (linhagens OD-21 e MDPC-23), que serão cultivadas em garrafas de cultura até a subconfluência. Em seguida, as células serão cultivadas em placas de 24 poços em uma concentração de 2 x 104 por poço e divididas em quatro grupos: células OD-21 sem adição do GSE (OD-21c), células OD-21 + 10 ¼g/mL de GSE (OD-21gse); células MDPC-23 sem adição do GSE (MDPC-23c); células MDPC-23 + 10¼g/mL de GSE (MDPC-23gse). Após 3, 7, 10 e 14 dias, serão analisados os seguintes parâmetros: proliferação e viabilidade celular, detecção in situ e atividade de fosfatase alcalina, quantidade de proteínas totais, além da detecção e quantificação de nódulos mineralizados. Os dados obtidos serão analisados por testes estatísticos e de normalidade, e o nível de significância será estabelecido em 5%. (AU)

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Este estudo tem por objetivo criar filmes de óxido de tântalo (Ta2O5) na superfície de titânio comercialmente puro (Ticp) por meio de pulverização catódica e avaliar seu comportamento eletroquímico, biocompatibilidade e formação de biofilme. Para isso, discos de Ticp serão divididos em dois grupos: superfície I - usinada (controle) e superfície II (experimental) - tratada com filme de Ta2O5. Para o ensaio eletroquímico, testes padrões como potencial de circuito aberto, espectroscopia de impedância eletroquímica e teste potenciodinâmico serão conduzidos em solução de fluido corpóreo (pH 7,4). A capacitância (Cdl) e resistência de polarização (Rp) da camada de óxido serão determinados por meio do circuito elétrico mais apropriado. O método de Tafel será utilizado para determinar a densidade de corrente de corrosão (Icorr) e o potencial de corrosão (Ecorr). A densidade de corrente de passivação (Ipass) corresponderá ao valor da corrente na transição entre a região ativa e passiva expressas na curva de polarização. A topografia dos discos será caracterizada através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de energia dispersiva (EDS), microscopia de força atômica (MFA), espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS), difratografia de raios-x (DRX), perfilometria e energia livre de superfície. Para os testes biológicos, será utilizada a linhagem celular pré-osteoblásticas MC3T3E1. A estrutura e morfologia celular serão avaliadas por MEV e microscopia de fluorescência. Reações de PCR em tempo real (qPCR) serão utilizadas para se determinar os níveis de expressão de genes osteogênicos. O ensaio de MTT será realizado para se avaliar a viabilidade/metabolismo celular, enquanto o ensaio de Alizarina vermelha será utilizado para identificar e quantificar o impacto das diferentes superfícies sobre a formação de depósitos minerais pelas células. A bioatividade das superfícies será testada pela imersão das amostras em fluido corpóreo. Para o teste microbiológico, biofilme composto por Streptococcus sanguinis será formado na superfície dos discos. Serão quantificadas as unidades formadoras de colônia (log UFC) e a análise estrutural do biofilme será realizada através da MEV. Os dados quantitativos serão submetidos à análise estatística mais apropriada com nível de significância de 5%. O número de espécimes para cada ensaio será determinado após o estudo piloto. (AU)

Resumo

A neurobiologia dos transtornos depressivos ainda não é completamente conhecida, mas é proposto que interações entre o sistema imunológico, estresse e sistema nervoso central (SNC) culminem em alterações neuroimunoendócrinas que facilitam o surgimento da depressão. Sabe-se que há aumento de citocinas pró-inflamatórias em indivíduos depressivos ou animais submetidos a estressores. Dentre esses mediadores, está a interleucina-1b (IL-1b), amplamente descrita como agente neuroinflamatório, antineurogênico e indutora de comportamentos tipo-depressivos em animais experimentais. A via de NFkB e o inflamassoma de NLRP3, complexo multiprotéico citosólico ativado em resposta a danos teciduais, alterações de metabolismo celular e infecções, medeiam a transcrição e função de IL-1b, induzindo a ativação do sistema imune inato e inflamação. A ativação do inflamassoma de NLRP3 tem sido amplamente descrita em modelos animais de estresse e pacientes depressivos possuem aumento de sua expressão em células mononucleares sanguíneas. A hiperativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) é observada tanto em humanos depressivos quanto em animais experimentais e já foi descrito que glicocorticoides sensibilizam a via do NLRP3. O canabidiol (CBD), composto não psicotomimético da Cannabis sativa, possui inúmeros efeitos terapêuticos já descritos - dentre os quais se destacam os tipo-antidepressivos e tipo-ansiolíticos em modelos animais, bem como atividade anti-inflamatória. Porém, a interação entre o CBD e o sistema imunológico no SNC, bem como seu possível envolvimento sobre os efeitos comportamentais da droga, ainda são pouco conhecidos. Desse modo, o presente projeto objetiva avaliar se o CBD é capaz de prevenir comportamentos pró-depressivos e relacionados à ansiedade, bem como alterações neuroimunoendócrinas, induzidas em camundongos submetidos a modelo de estresse crônico imprevisível. Pretende-se, ainda, verificar a participação do inflamassoma de NLRP3 nos efeitos do CBD. (AU)

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