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Resumo

O gene POU5F1 é responsável pela expressão da proteína OCT4, que é encontrada com expressão maior do que o normal em células tronco embrionárias e tumorais, e relacionada com a manutenção do estado indiferenciado. Nosso grupo detectou correlação entre aumento da expressão de POU5F1 e diminuição da sobrevida de pacientes com meduloblastoma, pelo aumento da agressividade do tumor por crescimento celular mais rápido, maior invasão celular, maior tumorigenicidade, e maior propensão a metástase. Observou-se também que a maior expressão dessa proteína afetou os níveis de outros transcritos como micro RNAs (miRNA), RNAs não codificadores de cadeia longa, RNAs nucleolares, e outras proteínas. Estudou-se melhor dentre esses transcritos o hsa-miRNA-367, que estava presente nas linhagens menos expresso do que o normal, e fez-se sua super-expressão in vitro e in vivo notando-se maior viabilidade nas células de meduloblastoma. Deduz-se, então, que os miRNAs encontrados com expressão afetada nas linhagens podem afetar a agressividade tumoral de meduloblastoma. Além disso carece informação sobre os mecanismos moleculares de atuação de OCT4 no aumento da agressividade de meduloblastoma na literatura. Assim surge a importância desse projeto, que pretende estudar, das implicações da concentração além do normal de OCT4, o hsa-miRNA-4719, o qual possui expressão menor do que o normal em linhagens de meduloblastoma, e sua relação com a nucleostemina, um possível alvo que encontra-se superexpresso nas mesmas linhagens, e que possui superexpressão também em outros tumores como glioblastomas e neuroblastomas, e em células tronco neurais, mas não na sua progênie diferenciada (TSAI; MCKAY, 2002). Caso o miRNA e a proteína não possuam relação direta pretende-se estudar os mecanismos da nucleostemina em meduloblastoma, pois há também chances de sua síntese ser controlada diretamente pelos transcritos do gene POU5F1. (AU)

Resumo

O splicing alternativo, no contexto da diversidade de produtos proteicos a partir de um número restrito de genes, carrega grande importância para a compreensão dos mecanismos que regem a fisiologia celular de diferentes tecidos. Nesse sentido ganha importância a compreensão de como tal mecanismo é regulado, principalmente pelos ditos fatores de splicing. Dentre eles, as proteínas da família NOVA, principalmente NOVA1, tendo em vista as descobertas relacionando esse fator á regulação de variados tipos celulares, como células beta-pancreáticas e células neurais. Assim como ocorre com outros fatores de splicing, a alteração na expressão de NOVA1 tem sido relacionada com o desenvolvimento de neoplasias. Nosso grupo recentemente demonstrou haver uma grande diferença na expressão desse fator entre células de tecidos neurais neoplásicas e não neoplásicas, justificando a investigação da função de NOVA1. Para alcançar esse objetivo, NOVA1 será silenciado por siRNA e o efeito deste silenciamento gênico será investigado por técnicas proteômicas em linhagens de glioblastoma. Assim, objetivamos analisar os possíveis alvos NOVA1 e compreender melhor os mecanismos envolvidos na gliomagênese: 1) Silenciamento por RNAi _NOVA1; 2) Ensaio de proliferação celular e viabilidade celular; 3) Expressão de mRNA-NOVA1 por RT-PCR e abundância de NOVA1 por Western Blotting e 4) Análise proteômica das células silenciadas versus a parental e NTC. (AU)

Resumo

Pacientes com glioblastoma, o tipo mais comum de neoplasia maligna do cérebro em adultos, apresentam prognósticos ruins com os protocolos terapêuticos disponíveis, sendo temozolomida (TMZ) a principal droga utilizada no tratamento desse tumor. TMZ é um agente alquilante que causa metilação no DNA e uma ampla gama de lesões no DNA (genômico e mitocondrial), levando a morte celular. Porém, tumores tratados com TMZ contam com diversos mecanismos de resistência. Um dos mecanismos principais refere-se a capacidade de reversão direta da lesão no DNA por MGMT (Metil Guanina Metil Transferase), cuja perda de expressão está associada a melhor prognóstico e sobrevida em pacientes tratados com TMZ. O aumento no nível de espécies reativas de oxigênio (ROS) também tem sido associada à resistência a TMZ. Nosso grupo mostrou que glutationa (GSH), um peptídeo que tem um papel crucial na manutenção da homeostase redox das células, previne a morte celular por TMZ, em mecanismo mediado pelo fator de transcrição NRF2. Porém não é claro se esse mecanismo envolve diretamente a redução de metilação do DNA genômico (e portanto sujeito à ação de MGMT) ou por dano gerado pelo estresse oxidativo. Sendo assim, a ideia inicial deste projeto é verificar, através da super-expressão de MGMT em células de glioma, qual o papel de metilações no DNA na morte induzida por TMZ, em relação a lesões provocadas pelo estresse oxidativo, em condições que os níveis de GSH é modulado.Outros mecanismos de resistência a TMZ já foram relatados. Através da geração de bibliotecas utilizando o sistema CRISPR (clustered regurlaly interspaced short palindrome repeats)-Cas9 (CRISPR-associated nuclease 9) (CRISPR-Cas9), nosso grupo identificou uma lista de genes potencialmente associados à resistência com TMZ. Entre esses genes a via de anemia Fanconi nos chamou atenção devido ao seu papel no reparo de DNA. É nossa expectativa que esse estudo forneça não apenas um melhor conhecimento dos mecanismos envolvidos na proteção das células tumorais ao tratamento com TMZ, como nos forneça dados que permitam oferecer alternativas para potencializar os efeitos quimioterápicos desse fármaco. (AU)

Resumo

Glioblastoma é o mais comum tumor primário cerebral, e apesar da combinação cirúrgica com tratamentos de radio e quimioterapia, o prognóstico ainda é muito ruim. O aumento da proliferação e migração celular desses tumores está diretamente relacionado com sua agressividade, a qual tem sido relacionada com as vias das Rho GTPases. Evidências funcionais do papel de RhoA em gliomas foram demonstradas com a inibição de ROCK, levando a ativação de Rac1 e aumento da invasão e migração celular. Além disso, já foi demonstrado que Rho GTPases atuam em mecanismos de reconhecimento e reparo de dano no DNA em células tumorais. Por exemplo, nosso grupo mostrou recentemente que a atividade de RhoA em linhagens tumorais humanas afeta a sensibilidade dessas células frente a radiação ionizante gama e não-ionizante ultravioleta, através de vias de reparo de DNA, como HR, NHEJ e NER, por mecanismos moleculares ainda desconhecidos. Assim, este projeto visa investigar a via de sinalização da GTPase Rho, incluindo seus componentes downstream e a própria polimerização do citoesqueleto de actina, em células de glioblastoma após serem submetidas a danos no DNA. Além disso, pretende-se investigar também se este envolvimento da via de Rho possui ou não dependência frente à proteína supressora de tumor p53 e ao estresse oxidativo promovido pelos tratamentos já existentes, como radiação-³ e cisplatina. Ao fim, pretende-se utilizar os resultados dessa pesquisa para aprofundar a elucidação de vias de sinalização envolvendo Rho GTPase e mostrar que tanto esta enzima como outros componentes desta via, bem como o próprio citoesqueleto de actina, são alvos promissores para o desenvolvimento e o emprego de novos tratamentos contra os diversos tipos de glioblastomas, ou mesmo do aperfeiçoamento de tratamentos já existentes. (AU)

Resumo

A barreira hematoencefalica (BBB) é uma das barreiras físicas mais importantes do organismo que atua impedindo a entrada de materiais exógenos ao sistema nervoso central (SNC). Embora ela tenha essa função de proteção, sua presença dificulta ou impede a passagem de fármacos destinados ao combate de tumores cerebrais. Algumas alternativas são abordadas na literatura na tentativa de contornar essa barreira, permitindo que os fármacos atinjam seu sitio de ação em concentrações necessárias para a obtenção do efeito terapêutico. Dentre elas, a utilização da via nasal para a administração de fármacos parece garantir uma conexão direta entre o meio externo e o SNC que evita a passagem pela BBB. Porém a via nasal apresenta algumas limitações como o seu ambiente enzimático e a ocorrência da depuração mucociliar. Estratégias tecnológicas podem ser utilizadas com o objetivo de maximizar a efetividade desta via de administração através da utilização de sistemas de liberação poliméricos capazes de proporcionar a compartimentalização e vetorização do fármaco, e ainda, dependendo da natureza desses polímeros, o estabelecimento de interações com a mucosa nasal aumentando o tempo de residência da formulação na cavidade. Quitosana e alginato são polímeros naturais e biocompatíveis que podem ser utilizados para esse propósito. Neste sentido, este projeto propõe a utilização de planejamento fatorial e ferramentas estatísticas para o desenvolvimento de nanopartículas poliméricas mucoadesivas de alginato e quitosana para a administração do ácido alfa-ciano-4 hidroxicinamico (CHC), capaz de atuar como agente terapêutico em células tumorais de glioblastomas. (AU)

Resumo

Glioblastomas (GBM) representam cerca de 77% dos tumores malignos que acometem o sistema nervoso central (SNC) e ainda hoje, apesar dos avanços em quimioterapia, radioterapia e neurocirurgia, possuem um prognóstico muito limitado. A existência de barreiras fisiológicas, especialmente barreira hematoencefalica (BBB), representa o principal obstáculo que limita a passagem de concentrações adequadas de muitos fármacos destinados ao seu combate. Por suas vantagens anatômicas, uma estratégia proposta para o fornecimento de agentes terapêuticos para o SNC consiste no uso da via nasal de administração, uma vez que ela evita a passagem pela BBB permitindo que o fármaco atinja o parênquima cerebral através de canais perineurais. Paralelamente, o entendimento do comportamento molecular das células tumorais aliado as pesquisas em biofísica, química e farmacologia sugerem que a terapêutica desta patologia deve englobar a abordagem de alvos múltiplos, ou seja, interferência em diferentes vias de sinalização de maneira simultânea, minimizando assim, a adaptação e resistência das células tumorais. A nanotecnologia vem integrar essas áreas de pesquisa fornecendo ferramentas tecnológicas que poderão proporcionar a entrega seletiva de fármacos, facilitar sua internalização ou ainda, conferir a liberação controlada do agente terapêutico no alvo intracelular. Seguindo este raciocínio, este projeto de pesquisa propõe o design racional de nanoparticulas multifuncionais combinando: a utilização dos polímeros alginato e quitosana, que apresentam propriedades mucoadesiva e a capacidade de interagir com constituintes do muco; a associação dos fármacos cetuximabe, um anticorpo monoclonal que atua no receptor de fator de crescimento epidermal inibindo a produção de fatores pró-angiogénicos e ácido alfa-ciano-4 hidroxicinamico (CHC), molécula capaz de inibir a atividade dos transportadores responsáveis pelo efluxo de ácido lático para o meio extracelular ocasionando a acidose das células tumorais; e as vantagens anatômicas da cavidade nasal quando se deseja atingir o SNC, possibilitando desta maneira, um futuro mais favorável a terapêutica dos GBM. (AU)

Resumo

O glioblastoma é o tipo mais comum e agressivo de glioma, um tumor de Sistema Nervoso Central (SNC) formado por células gliais que apresenta 100% de letalidade. Dados da literatura apontam para uma subpopulação tumoral que apresenta características de células-tronco, chamadas células-tronco de glioblastoma (CTGs), que seria responsável pela proliferação, invasão, resistência à terapia, angiogênese e recidiva tumoral. Portanto, a elucidação dos mecanismos que governam a biologia destas células é essencial para o desenvolvimento de terapias mais eficazes contra o GBM. Neste estudo visamos identificar o papel das proteínas prion celular (PrPC), uma glicoproteína ancorada à membrana plasmatica e seu ligante, stress inducible protein 1 ou heat shock organizing protein (STI1/HOP), uma co-chaperona abundantemente secretada por células do SNC, na manutenção da proliferação e autorrenovação de CTGs. Linhagens de glioblastoma humano U87 e U251 cultivadas como neuroesferas e enriquecidas de células-tronco foram utilizadas como modelo de estudo. Populações expressando baixos níveis de PrPC e/ou HOP, através de knockdown por sistema lentiviral ou knockout por CRISPR/Cas9, foram utilizadas para compreensao da função destas proteínas na biologia de células-tronco. Nossos resultados demonstram que o silenciamento de PrPC é capaz de reduzir a expressão de marcadores de células-tronco como Sox2 e CD133 e inibir a autorrenovação celular, indicando PrPC como uma molécula chave para a manutenção do estado indiferenciado de CTGs. Além disso, observamos co-localização e co-expressão de PrPC e CD133 na superfície celular, sendo a internalização de CD133 estimulada com íons cobre e associada a PrPC, sugerindo a modulação da expressão de CD133 na membrana plasmática por PrPC. Adicionalmente, o silenciamento de PrPC diminui a expressão de proteínas de adesão, como E-caderina e ±6-integrina, e afeta diretamente a migração celular, implicando PrPC em processos de invasão tumoral. Interessantemente, o peptídeo de HOP que mimetiza o sítio de interação a PrPC (pepHOP230-245) é capaz de bloquear a formação do complexo na superfície e inibir a proliferação e autorrenovação mediada por HOP em células positivas para PrPC. Por sua vez, o silenciamento de HOP reduz a proliferação celular, a qual pode ser recuperada com o tratamento com HOP recombinante em células que expressam PrPC, indicando um papel importante deste complexo na proliferação de CTGs. Observamos que a tumorigenicidade de neuroesferas expressando baixos níveis de PrPC e/ou HOP é significativamente reduzida, bem como a capacidade proliferativa destas células in vivo, indicando o complexo PrPC-HOP como potencial alvo para o desenvolvimento de novas terapias com base no controle da proliferação de CTGs. (AU)

Resumo

Os astrocitomas são os tumores cerebrais primários mais comuns em adultos e são classificados em astrocitoma difuso de baixo grau (grau II), astrocitoma anaplástico (grau III) e glioblastoma multiforme (grau IV). O glioblastoma multiforme (GBM), tumor cerebral primário mais comum e letal em adultos, é caracterizado pela alta invasividade e resistência à rádio e quimioterapia. A proteína Holliday Junction-Recognizing Protein (HJURP) é altamente expressa nos casos de GBM e estudos do nosso grupo apontaram que a HJURP está envolvida em processos de reparo do DNA, estabilidade e segregação cromossômica e modulação dos mecanismos de apoptose e senescência. Pesquisas do nosso laboratório mostraram que células superexpressoras de HJURP apresentam maior taxa de proliferação e capacidade clonogênica e menor estresse replicativo. Por outro lado, a redução de HJURP promoveu aumento nos níveis de apoptose em linhagens celulares de GBM, enquanto que células não tumorais não são significativamente afetadas. O objetivo da pesquisa é verificar o impacto do silenciamento da HJURP na capacidade de proliferação e manutenção do estresse replicativo em células de GBM. Para isso, serão analisadas linhagens celulares que expressam um short hairpin RNA (shRNA) dirigido para HJURP e determinadas a curva de proliferação, os níveis de expressão de HJURP e a quantificação da ativação de RPA (marcador de estresse replicativo) e de quebras na dupla-fita de DNA após tratamento com camptotecina, droga que inibe a topoisomerase e causa estresse replicativo. (AU)

Resumo

O sistema nervoso central (SNC) é constituído por astrócitos (50%), oligodendrócitos (40%), micróglia (5%) e células ependimárias (5%), os quais oferecem o suporte estrutural e funcional para os neurônios. Em especial os tumores da glia (glioma ou glioblastoma) estão entre as neoplasias mais comuns do SNC adulto e surgem a partir de astrócitos, oligodendrócitos e seus precursores. O glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais agressivo e frequente desses tumores. Outro problema grave que acomete o SNC é o chamado acidente vascular cerebral (AVC), o qual é causado pela redução do suprimento sanguíneo, resultando no decréscimo da oferta de oxigênio e glicose em uma área do cérebro. Um terceiro problema grave é a presença de sangue no espaço subaracnoideo devido à hemorragia meníngea, o que leva ao vasoespasmo das artérias cerebrais. Todos os tratamentos existentes atualmente para os acometimentos cerebrais aqui relatados são pouco eficazes, resultando em um grande número de pacientes com sequelas neurológicas graves ou mortes. Por isso, existe a necessidade de desenvolver uma abordagem terapêutica mais efetiva. Este projeto esta basicamente dividido em cinco subprojetos, sendo três relacionados ao glioblastoma, um relacionado ao vasoespasmo cerebral e outro referente à isquemia cerebral focal. Os estudos propostos neste projeto nos parecem de extrema relevância, visto que a utilização de novas tecnologias, em um tema já explorado, mas, com pouco sucesso, parece ser a chave para a descoberta de novas estratégias terapêuticas. Logo, a linha mestra comum que une todas as propostas é a combinação de Nanotecnologia, Fotoprocesso e Terapia Celular para o tratamento de patologias do SNC. (AU)

Resumo

O sistema nervoso central (SNC) é constituído por astrócitos (50%), oligodendrócitos (40%), micróglia (5%) e células ependimárias (5%), os quais oferecem o suporte estrutural e funcional para os neurônios. Em especial os tumores da glia (glioma ou glioblastoma) estão entre as neoplasias mais comuns do SNC adulto e surgem a partir de astrócitos, oligodendrócitos e seus precursores. O glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais agressivo e frequente desses tumores. Outro problema grave que acomete o SNC é o chamado acidente vascular cerebral (AVC), o qual é causado pela redução do suprimento sanguíneo, resultando no decréscimo da oferta de oxigênio e glicose em uma área do cérebro. Um terceiro problema grave é a presença de sangue no espaço subaracnoideo devido à hemorragia meníngea, o que leva ao vasoespasmo das artérias cerebrais. Todos os tratamentos existentes atualmente para os acometimentos cerebrais aqui relatados são pouco eficazes, resultando em um grande número de pacientes com sequelas neurológicas graves ou mortes. Por isso, existe a necessidade de desenvolver uma abordagem terapêutica mais efetiva. Este projeto esta basicamente dividido em cinco subprojetos, sendo três relacionados ao glioblastoma, um relacionado ao vasoespasmo cerebral e outro referente à isquemia cerebral focal. Os estudos propostos neste projeto nos parecem de extrema relevância, visto que a utilização de novas tecnologias, em um tema já explorado, mas, com pouco sucesso, parece ser a chave para a descoberta de novas estratégias terapêuticas. Logo, a linha mestra comum que une todas as propostas é a combinação de Nanotecnologia, Fotoprocesso e Terapia Celular para o tratamento de patologias do SNC. (AU)

Resumo

O glioblastoma multiforme (GBM) representa 15-20% dos tumores neurológicos sendo considerado o mais agressivo. A heterogeneidade biológica e a resistência a quimioterápicos são os maiores obstáculos para o tratamento efetivo do GBM. Vários genes e vias de sinalização têm sido apontados como responsáveis pelo fenótipo agressivo desse tumor, uma delas é a via de sinalização NF-ºB. Em mamíferos são conhecidas cinco proteínas desta família, as quais fazem parte de duas vias conhecidas como canônica e via alternativa: RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-ºB1 (p105/p50) e NF-ºB2 (p100/p52). Essas proteínas formam vários homodímeros e heterodímeros e são mantidas inativas por associação citoplasmática com proteínas inibitórias. A via NF-ºB canônica é a mais estudada em vários tipos tumorais, incluindo o GBM, no qual se encontra continuamente ativa regulando o aumento da expressão de genes anti-apoptóticos e fatores de sobrevida, adesão e invasão celular. microRNAs (miRNAs) envolvidos na regulação da via NF-ºB foram pouco estudados no GBM. Estudos recentes utilizando doses orais de ácido glicirrízico (AG) mostraram redução do processo inflamatório, por suprimir a expressão da proteína nuclear NF-ºB e p65, e por aumentar a expressão da proteína supressora tumoral p53 e das proteínas pró-apoptóticas caspase-9 e caspase-3 clivadas. O glicirrizinato dipotássio (DPG) é um subproduto do AG e assemelha-se aos corticóides quanto às suas propriedades anti-inflamatórias, porém sem apresentar os mesmos efeitos colaterais. Assim, o objetivo desse estudo é avaliar o efeito inibitório do DPG na via de sinalização NF-ºB através da modulação de miRNAs previamente conhecidos como envolvidos com essa via, em linhagens celulares de GBM, como alvo terapêutico para a doença. (AU)

Resumo

Os tumores que acometem o sistema nervoso central (SNC) correspondem a cerca de 2% de todos os tipos malignos descritos, no entanto, devido a elevada taxa de mortalidade, constituem um importante problema de saúde pública. Dentre os tumores de SNC, os gliomas são responsáveis por cerca de 70% deles, que podem ser divididos em distintos graus de malignidade. Os astrocitomas de grau IV, ou glioblastomas (GBM), correspondem a 50% dos casos e podem manifestar-se em qualquer idade, mas sobretudo adultos. A opção de tratamento padrão para os glioblastomas consiste em ressecção cirúrgica ampla, ou parcial seguida de um regime combinado de radioterapia e quimioterapia adjuvante, principalmente com a temozolamida (TMZ). Apesar do avanço terapêutico, a maioria dos casos continuam incuráveis e a ineficiência dos resultados clínicos deve-se principalmente a elevada capacidade infiltrativa desse tipo tumoral, assim como a resistência intrínseca aos fármacos utilizados. GBMs são tumores muito heterogêneos do ponto de vista molecular e apresentam diversas alterações, dentre elas, a deleção da região 9p21, onde está localizado o gene supressor tumoral, MTAP (Methylthioadenosine phosphorylase), que atua na via de poliaminas e na reciclagem de adenina e metionina. A falta desta proteína pode ser utilizada como uma nova estratégia de tratamento para glioblastomas, utilizando-se fármacos que atuem na via da síntese de novo de purinas. Neste contexto, a avaliação dos efeitos funcionais da perda de expressão de MTAP em linhagens celulares de GBM, assim como a busca por novas abordagens terapêuticas, como a combinação de inibidores específicos da via de síntese de novo, juntamente ao efeito da adição de moléculas adjuvantes, se mostra potencialmente importante e pode constituir um grande auxílio no conhecimento e desenvolvimento de novas linhas de tratamento para pacientes acometidos por esta doença fatal. (AU)

Resumo

Células-tronco tumorais de glioblastoma (GSC) consistem de uma subpopulação intratumoral de células em estado indiferenciado, as quais são postuladas como capazes de reiniciar o processo de tumorigênese após o tratamento convencional dos pacientes. Analogamente a população fisiológica de células-tronco neurais, as GSC são capazes de auto-renovar mantendo a capacidade de diferenciar em outros tipos celulares, originando nesse caso demais populações de células tumorais e capazes de recapitular a heterogeneidade celular encontrada no tumor original. Apesar de ambas populações celulares partilharem da expressão de diversos marcadores típicos de células-tronco, apenas GSC apresentam a distinta capacidade tumorigênica, além da de evasão ao tratamento quimioterápico e posterior re-propagação do GBM. O objetivo desse estudo BEPE-DR é responder se é possível usar um aptâmero para a concepção de um sistema direcionado para entrega de drogas contra GSCs. Para isso, o estudo propõe a identificação e modificação de um aptâmero para internalização e liberação de uma droga citotóxica para GSCs em colaboração com o Prof. Dr. Günter Mayer, líder do Centro de Aptâmeros do Life & Medical Sciences Institute (LIMES), Universidade de Bonn. Previamente, a biblioteca randômica de moléculas de ssDNA (candidatos pré-aptâmeros) foi enriquecida exponencialmente através da técnica de Cell-Selex, empregando-se ciclos positivos de seleção positiva contra as GSCs alternados com ciclos de seleção negativos contra células não-GSC. A seguir, representando o projeto BEPE, o conjunto de moléculas apresentando maior afinidade para os GSCs serão utulizadas para predição das respectivas estruturas terciárias e seleção das moléculas candidatas. Para isso, uma análise das sequências será realizada com o objetivo de identificar e modificar motivos G-quadruplex estratégicos, visando assim a obtenção de aptâmeros internalizantes para as GSCs. O potencial das moléculas candidatos em internalizar será avaliado através de ensaios cinéticos de internalização e de microscopia confocal. Em seguida, os potenciais aptâmeros serão conjugados com agente citotóxico e a entrega direcionada em GSCs, seguida da morte das células de GBM, serão avaliadas. Através da demonstração de um aptâmero capaz de internalizar e entregar uma droga especificamente em GSCs, o estudo propõe a obtenção de um sistema quimioterapeutico para GSCs cujas perspectivas incluem posterior identificação dos alvos ligantes para a internalização específica, assim contribuindo para a elucidação de alvos terapêuticos na biologia tumoral e validação de aptâmeros como ferramentas para entrega específica de drogas. (AU)

Resumo

Gliomas são os tumores primários intracranianos mais comuns. Gliomas de alto grau, também chamados de glioblastomas, são os mais frequentemente encontrados, portando o pior prognóstico (12 meses de expectativa de vida após diagnóstico). A terapia destes tumores cerebrais tem sido limitada pela ausência de métodos efetivos de endereçamento farmacológico, sendo essencial buscar novas abordagens para desenvolver novas estratégias na terapia de gliomas.Peptídeos e proteínas com a capacidade de serem internalizados por células tem sido objeto de estudo nos últimos anos, já que a transdução da membrana celular é crítico para o endereçamento farmacológico e terapia gênica. Significativamente, o advento da técnica de Phage display proporcionou um poderosa ferramenta, na qual bacteriófagos são utilizados, in vivo e in vitro, para seleção de peptídeos e proteínas que facilitam a penetração, provavelmente por desencadear um processo de endocitose mediada por receptor. Durante o projeto de doutorado de Túlio Pereira Caracterização das isoformas de ENC1 (NRP/B) e identificação de peptídeos internalizados por glioblastoma humano (Projeto FAPESP 2016/01626-9), dois diferentes peptídeos foram selecionados durante ensaios de internalização em linhagens celulares de glioblastoma humano. Este projeto de estágio no exterior de três meses objetiva-se na identificação dos pares ligantes destes peptídeos, em colaboração com a Dra. Renata Pasqualini, que dirige um instituto na Universidade do Novo México, Albuquerque, Novo México, USA, sendo reconhecida mundialmente por suas contribuições a Oncologia usando a tecnologia de Phage Display. (AU)

Resumo

Estímulos estressores desencadeiam na maioria das linhagens celulares mecanismos redutores do estresse e de sobrevivência celular como a "Unfolded Protein Response" (UPR) .Esse tipo de resposta ao estresse celular causa um aumento na secreção de vesículas pelo RE e aparelho de Golgi, que quando são secretadas por essas células passam a denominar-se exossomos. Presentes nos fluidos corporais como sangue, urina, saliva e liquor, essas microvesículas possuem em sua composição mRNAs, microRNAs, RNAs não codificantes, proteínas citoplasmáticas e de membrana, como receptores e moléculas do complexo MHC que são candidatos à biomarcadores de doença. Estudos recentes apontam que a comunicação intercelular pelos exossomos pode modular expressão gênica da célula alvo, assim como processos de crescimento, divisão e diferenciação celular, resposta ao estresse, sobrevivência celular e apoptose. Entretanto, essas propriedades, vem se demonstrando presentes também em células tumorais, onde, a secreção de exossomos pelas células tumorais influenciam na progressão tumoral e no desenvolvimento de metástases. Devido suas propriedades e presença em fluidos corporais onde possam ser coletados, os exossomos estão se tornando candidatos promissores de novos biomarcadores para realização de diagnósticos precoce e prognóstico de inúmeras doenças, entre elas o câncer. Dessa maneira, nós trataremos linhagens celulares de glioblastoma, U87MG e T98G, com drogas indutoras de estresse celulares que possuem diferentes mecanismos de ação, como thapsigargin, tunicamicyn e temozolamide e avaliar a liberação de exossomos, caracterizando o perfil proteômico dessas vesículas por meio de analise shotgun proteomics utilizando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. (AU)

Resumo

Apresentando um relevante papel na imunidade inata, o receptor do tipo Toll 4 (TLR4) reconhece moléculas endógenas e exógenas. No início da sinalização, o receptor ativa a via MyD88, desencadeadora de uma resposta pró-inflamatória e que pode modular uma via de proliferação. Essa ativação leva à produção de citocinas através do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-ºB). Após a ativação, o receptor é internalizado para o endossomo e sinaliza via TRIF, produzindo resposta anti-inflamatória e pode desencadear uma via de apoptose. Em células tumorais, verificou-se que a expressão de TLR4 pode levar à proliferação e à sobrevivência celular. A presença deste receptor nas células de glioblastoma (GBM), observada em nosso laboratório, motivou o presente estudo. O objetivo principal é verificar o papel do TLR4 nas células de linhagem tumoral de GBM, no que tange a proliferação e morte celular, e o envolvimento da via de sinalização NF-kB. Serão feitos ensaios de proliferação e de apoptose após estímulo com LPS, seguido de extração proteica dos compartimentos nuclear e citoplasmático para verificação do NF-kB por Western Blot. Será feita, também, análise dos produtos da transcrição do NF-kB e da via de ativação endossômica do TLR4 por qPCR. A importância desta pesquisa está na expectativa de melhor compreender a dinâmica da ativação de TLR4, que leva à proliferação e/ou à apoptose celular, e contribuir com novas estratégias terapêuticas em GBM. O tema do projeto insere-se dentro da linha de colaboração com o Dr Bart J. L. Eggen, da Universidade de Groningen (Holanda). O estudo do TLR4 será estendido, como próximo passo para o estudo da sua expressão e de seu papel na micróglia, a célula não-neoplásica mais abundante do microambiente tumoral dos gliomas, onde a interação entre estes dois compartimentos tem sido descrita como moduladora da progressão tumoral. (AU)

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Dentre as doenças mais graves que afetam o SNC estão o glioblastoma multiforme e a encefalopatia séptica. Cerca de 4% dos cânceres no Brasil acomete o SNC, sendo o mais frequente e devastador o glioblastoma multiforme (OMURO & DEANGELIS, 2013). Frequente também é o número de indivíduos acometidos por encefalopatia séptica, alcançando 71% dos pacientes diagnosticados com choque séptico (PAPADOPOULOS et al., 2000). Como fatores importantes para o desenvolvimento dessas doenças estão inflamação e desequilíbrio oxidativo (BALKWILL & MANTOVANI, 2001; SIAMI et al., 2008). Nanopartículas de ouro (AuNPs) têm enorme potencial no combate a essas doenças, uma vez que possuem propriedades anti-inflamatória e antioxidante intrínsecas (UCHIYAMA et al., 2014). Dessa forma, propomos estudar o efeito do tratamento com AuNPs sobre a expressão de marcadores inflamatórios e oxidantes em animais com glioblastoma multiforme ou encefalopatia séptica. Para isso, sepse será induzida em camundongos utilizando o modelo de ligação e perfuração intestinal, enquanto glioblastoma multiforme será obtido por implante intracerebral da linhagem de células de glioblastoma murinho, GL261. Os animais serão tratados, intravenosamente (IV), com AuNPscit ou AuNPs-IgG (10 elevado a 12 partículas/mL), e como controle dos tratamentos com as AuNPs, solução contendo o anticorpo anti-H3.3, utilizada para preparar as AuNPs-IgG, ou solução de aurotiomalato de sódio (Sigma-Aldrich), em dose anti-inflamatória, 0,7 ¼g/g de massa corpórea, dissolvido em solução fisiológica, de acordo com o descrito por SIN & WONG (1992), ou solução fisiológica, em dose única, intravenosa, 2 ou 4 horas após indução da sepse, ou injetados em dias alternados durante 20 dias, iniciando 7 dias após indução do tumor. Após 6 horas da indução da sepse ou ao final de 20 dias de tratamento dos animais com tumor, os camundongos serão sacrificados e os seus cérebros coletados e congelados (-80oC) para posterior determinação das expressões proteicas de: iNOS e gp91phox, para cérebros sépticos, ou antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA, "proliferating cell nuclear antigen") e fator de crescimento epidermal (EGF, "epidermal growth factor"), para cérebros com tumor, por Western blotting. Da mesma forma, o sangue desses animais será coletado para determinação da expressão proteica de L-selectina e CD18, em leucócitos; e P-selectina e alpha(IIb)beta(3) integrina, em plaquetas, por citometria de fluxo. (AU)

Resumo

Gliomas são tumores originados das células da glia e apresentam uma classificação basicamente histológica, que é dividida em graus. O glioma de grau IV, também conhecido como glioblastoma, é o mais agressivo e apresenta o pior prognóstico com alta taxa de recorrência. A correta classificação do tumor é um importante critério na escolha de terapias, porém, a metodologia atual para a determinação do grau não é precisa. O estudo dos aspectos moleculares dos glioblastomas é importante para desenvolver novas técnicas de diagnóstico e terapia, que possam aumentar o prognóstico e melhorar a qualidade de vida de pessoas com tumores cerebrais. Dentre os aspectos moleculares dos glioblastomas atualmente em estudo, podemos destacar o efeito dos eicosanoides e a influência das proteínas de resistência a múltiplas drogas na resistência ao tratamento. Os eicosanoides são moléculas derivadas de ácidos graxos e que são representados principalmente por: prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos. Observou-se que enzimas produtoras de eicosanoides, como as ciclooxigenases, são superexpressas em tumores cerebrais e que isso pode favorecer a tumorigênese. A expressão de proteínas de resistência a múltiplas drogas está presente em muitas linhagens de glioblastomas, desencadeando um fenótipo de resistência a quimioterápicos que dificulta o tratamento do tumor. Atualmente, são poucas as informações sobre biologia molecular dos glioblastomas, sendo necessárias pesquisas que visem esclarecer o comportamento maligno do tumor e que favoreçam o desenvolvimento de terapias a partir de novos alvos moleculares. (AU)

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Calicreínas (KLKs) são uma família de serino-proteases com especificidade semelhante à tripsina ou quimotrispsina. Pertencem às calicreínas, 15 membros denominados KLK1 a KLK15, que compreendem o maior cluster de genes de proteases do genoma humano e possuem cerca de 40% de semelhança estrutural entre si. As KLKs estão envolvidas com diversas funções fisiológicas, como mecanismos que regulam a descamação da pele, formação do esmalte dentário, função renal, liquefação seminal, plasticidade sináptica neural e funcionamento cerebral. No sistema nervoso central, a calicreína predominantemente expressa é a KLK6, sendo que a desregulação dessa enzima pode estar envolvida com desordens como mal de Alzheimer, mal de Parkinson e esclerose múltipla, além de estar envolvida em processos de desmielinização. Alterações na expressão de KLK6 também podem estar relacionadas com a diminuição da sensibibilidade de células tumorais à agentes citotóxicos como tratamentos quimioterápicos e radioterápicos. A KLK8 também é expressa no SNC em áreas do sistema límbico, sendo que sua desregulação é relacionada ao desenvolvimento de esquizofrenia. Estudos recentes mostraram o envolvimento de calicreínas humanas na replicação do Papilomavírus Humano e vírus da Influenza. O Citomegalovírus Humano é um agente viral de alta prevalência mundial. Em indivíduos imunocompetentes o vírus permanece em estado persistente ou de latência, caracterizado pela ausência de replicação viral. Em casos de imunosupressão, como em transplantados, AIDS, câncer e neonatos, o vírus pode ser reativado, entrando em fase lítica replicativa e desencadeando diversas patologias. A presença do HCMV em tumores tem sido reportada em diversos estudos. É sugerido que o vírus possui um papel oncomodulatório, aumentando a malignidade tumoral. Gliomas são os tipos mais comuns de tumores do sistema nervoso central. São divididos principalmente em astrocitomas (graus I a IV) e oligodendrogliomas (graus II e III). O glioblastoma multiforme ou astrocitoma de grau IV é o tipo mais maligno e infiltrativo de glioma, com baixa sobrevida a partir do diagnóstico. A presença do HCMV em gliomas foi reportada em diversos estudos e no Brasil por nosso grupo de pesquisa e investigações recentes estudam os possíveis mecanismos moleculares relacionadas ao vírus e a progressão tumoral. Esse projeto tem como objetivo avaliar a expressão e atividade de calicreínas durante a infecção de células de glioblastoma pelo HCMV, bem como suas consequências na replicação viral (AU)

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As células gliais (astrócitos, oligodendrócitos, micróglia e epêndimócitos), as mais numerosas no cérebro humano, oferecem suporte nutricional, sanguíneo, estrutural e de defesa aos neurônios. Elas podem sofrer mutações dando origem a células tumorais gliais, ou gliomas, dentre os quais, 70% derivam de células astrocíticas. O desenvolvimento de tumores é frequentemente atribuído a um acúmulo de alterações genéticas que permitem às células escaparem ao controle normal da proliferação, apoptose e migração celular. Nosso grupo tem demonstrado a participação de proteínas heat shock, como GRP78 envolvida em UPR e HSPB1/HSP27, com grande impacto na sobrevida de pacientes com GBM. Chaperones moleculares são proteínas consideradas chave na manutenção do proteoma, uma vez que facilitam o enovelamento de polipeptídeos nascentes, bem como no enovelamento e/ou degradação de proteínas mal dobradas. A expressão e a atividade das chaperones moleculares são fortemente regulados, tanto a nível transcricional e pós-translacional no estado do organismo de aumento oxidativo e, consequentemente, o estresse proteotóxico, incluindo no estado de envelhecimento e doenças relacionadas como câncer. Para alcançar esse objetivo pretendemos estudar: 1) Papel das proteínas de heat shock em estresse celular e UPR em linhagens celulares de glioblastoma através de ensaios de proliferação, migração celular, mudanças no proteoma baseado em espectrometria de massas e validação através de Western blot; 2) Intercomunicação celular, através do isolamento e caracterização do perfil proteômico de exossomos originados das linhagens de glioblastoma sob condições de estresse celular e 3) Mecanismos de ação de novas drogas isoladas de produtos naturais, AM04 e AM05, comparados à ação de temozolamida. Com essas abordagens proteômicas e de processos biológicos espera-se contribuir para a obtenção de novas drogas e aumentar o conhecimento da biologia de câncer. (AU)

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O glioblastoma (GBM) é um tumor agressivo e de prognóstico desanimador. O principal protocolo quimioterápico inclui o agente alquilante temozolomida (TMZ). Vias de reparo do DNA, como a mediada pela enzima MGMT (O6-methylguanine-DNA methyltransferase) e o reparo por excisão de base (Base Excision Repair - BER), promovem resistência às lesões de base induzidas pela TMZ, constituindo um grande entrave ao alcance de eficácia terapêutica. Uma estratégia emergente se baseia na intervenção dos mecanismos de reparo do DNA, objetivando uma potencial sensibilização das células tumorais. Um alvo estratégico é a proteína PARP-1 (Poli(ADP-Ribose) polimerase 1), participante de vários processos de reparo do DNA, com destaque para a via BER. Há evidências na literatura de que a inibição dessa enzima associada aos tratamentos empregados para pacientes com câncer resulta na sensibilização das células tumorais. Entretanto, a eficácia da associação de TMZ e inibidores de PARP tem sido correlacionada à atividade da enzima MGMT, embora o seu papel como marcador de resposta a este tratamento ainda permaneça controverso na literatura. No presente grupo de pesquisa, encontra-se em andamento o projeto "Inibição de reparo do DNA em linhagens de GBM visando uma possível aplicação como estratégia terapêutica" (conforme mencionado na justificativa do projeto). A bolsa IC em solicitação faz parte desse projeto, sendo que a hipótese a ser testada se baseia no estudo do papel de MGMT como preditor da resposta ao tratamento combinado de TMZ e NU1025, no sentido de que as células deficientes para essa enzima são sensíveis à ação da TMZ, a qual induz lesões citotóxicas que se acumulam na ausência da atividade de MGMT; por outro lado, as células proficientes para a enzima, ou seja, resistentes à droga pela capacidade em reparar essas lesões, são sensibilizadas pela inibição de PARP-1 no tratamento combinado com a TMZ, devido a outros tipos de danos induzidos pela droga, os quais não sofrem reparo devido à inibição de PARP-1 (intervenção na via BER), elevando as taxas de morte celular (conforme dados obtidos pelo grupo). Portanto, o objetivo do presente projeto é avaliar a influência de MGMT como modulador da resposta de células de GBM ao tratamento combinado de TMZ e NU1025, por meio da estratégia de inibição da enzima pelo composto O6-BG (O6-benzilguanina), em células GBM proficientes para MGMT. Os parâmetros analisados para a caracterização das respostas celulares serão: viabilidade celular, cinética de progressão no ciclo celular, indução de morte celular por apoptose, indução de quebras de fita dupla no DNA (DSB) e geração mitocondrial de espécies reativas de oxigênio (ROS). Assim, segundo a presente hipótese, a inibição da enzima MGMT anularia a ação potencializadora do tratamento combinado de NU1025 e TMZ. O projeto tem grande potencial em gerar informações relevantes para a prática clínica, as quais serão fundamentais para estratificação de pacientes (de acordo com a atividade de MGMT nas células tumorais), discriminando aqueles que têm potencial para responder com sucesso ao tratamento combinado de TMZ e inibidores de PARP. (AU)

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O glioblastoma (GBM) é um tumor cerebral maligno com péssimo prognóstico e muito resistente ao tratamento. As células-tronco do glioma (CTG) não diferenciadas apresentam uma maior defesa antioxidante quando comparadas com as CTGs diferenciadas com soro, sendo resistentes à quimioterapia e radioterapia. Propomo-nos a analisar algumas das principais proteínas/ genes expressos relacionados a defesa antioxidante (por exemplo, glutationa, glutationa peroxidase, glutationa redutase, catalase, peroxiredoxina, superóxido dismutase, etc) em CTGs não-diferenciadas ou diferenciadas expostas a baixas doses de radiação de forma crônicas ou agudas, por Western Blot, ELISA e RT qPCR. As proteínas que apresentarem os níveis de expressão mais elevados nas CTGs não-diferenciadas serão utilizadas como alvos para potencializar os efeitos da radiação. Isto será realizado por meio de shRNA específicos para a enzima antioxidante, ou outras proteínas necessárias para a biossíntese de antioxidantes não enzimáticos. Vários parâmetros serão analisados, como a geração de ROS (detecção por DHE e Mitosox), o estresse oxidativo (detecção de 8-oxo-dg), diferenciação celular (marcadores de célula tronco e diferenciação) e auto-renovação (ensaio de formação de esferas), em CTG silenciadas para a enzima antioxidante, irradiadas ou não-irradiadas. A nossa hipótese é a de que a redução da capacidade antioxidante das CTG e o aumento da produção de ROS por irradiação de baixa dose de forma crônica e aguda irá reduzir a funcionalidade das CTG, promovendo a diferenciação e diminuindo a auto-renovação. Para alcançar estes resultados, os experimentos serão realizados no laboratório do Dr. Siamak Haghdoost, na Universidade de Estocolmo, que apresenta todos os recursos para realizar as técnicas necessárias deste projeto. Espera-se que o presente estudo proporcione resultados interessantes sobre a radiossensibilização do glioma e que estes possam ser utilizados para a concepção de terapias alternativas para pacientes com GBM, em uma nova abordagem com base na diminuição da defesa antioxidante combinado com a radioterapia. (AU)

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Gliomas são o tipo mais comum de tumores cerebrais primários. O tipo mais agressivo, o glioblastoma multiforme (GBM) é uma das doenças humanas mais mortais, com uma sobrevida média de aproximadamente 1 ano. Evidências prévias sugerem uma ligação entre o citomegalovírus humano (HCMV) e gliomas. Foi mostrada a presença do HCMV nesses tumores e várias proteínas virais podem ter propriedades oncogênicas em celulas de gliomas. Aqui investigamos a presença de DNA, RNA e proteína viral em 52 amostras de gliomas de diferentes graus de malignidade. A região viral UL83, o RNA precoce beta 2.7 e uma proteína viral foram detectados em 73, 36 e 57 porcento das amostras por qPCR, IHC e ISH, respectivamente. A positividade dos alvos virais e carga viral foram independentes do tipo e malignidade dos tumores, sugerindo que não há correlação entre a presença viral e a progressão tumoral. Nossos resultados apresentam uma alta prevalência do HCMV em gliomas de pacientes brasileiros, contribuindo para um melhor entendimento da associação entre a infecção por HCMV e gliomas mundialmente em suportando futuras investigações acerca das propriedades oncomodulatórias do vírus. (AU)

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Glioblastoma Multiforme (GBM) consiste na mais frequente e letal malignidade intracraniana humana. Devido à alta taxa de recorrência, ao péssimo prognóstico e a ineficiência das terapias existentes, surge a necessidade do melhor entendimento dos mecanismos de controle da invasão em GBM para o desenvolvimento de intervenções que inibam o avanço dessa neoplasia. A família ADAM consiste em um grupo de proteínas de desintegrinas e proteases dependentes de zinco que exercem papéis fundamentais em diversos processos que contribuem para homeostase fisiológica e para diversas patologias, como o câncer. ADAM23 apresenta-se preferencialmente expressa no sistema nervoso central e possui um papel fisiológico crucial na diferenciação neuronal e no desenvolvimento cerebral. Em tecidos neoplásicos tem sido descrito o silenciamento da expressão do gene ADAM23 em uma variada gama de tumores, como: mama, pâncreas, tumores gástricos, de cabeça e pescoço, colorretais, de pulmão e tumores ósseos. Apesar da relevância da expressão de ADAM23 durante o desenvolvimento embriológico e do cérebro normal e de sua inativação durante a progressão de diferentes neoplasias, pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares regulados por este gene. Em análises recentes, constatamos que o silenciamento do gene ADAM23 é um evento mais frequente em astrocitomas de grau IV quando comparados com pacientes com astrocitoma difusos de baixo grau ou de grau I, sugerindo que ADAM23 esteja sendo silenciado durante a progressão dos gliomas. Além disso, notamos pela primeira vez que ADAM23 inibe a invasão celular e a presença nuclear de ²-catenina em modelo de neuroesfera de GBM. Conhecendo a importância da via de Wnt para a progressão dos GBMs, somado aos nossos dados sustentando a hipótese de que ADAM23 atue como um controlador da via de Wnt, este projeto surge com o propósito de aprofundar este entendimento e estudar os mecanismos moleculares de controle do fenótipo invasivo decorrente do silenciamento de ADAM23 em GBM, com foco principal sobre a via de Wnt. (AU)

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Gliomas difusos consistem nos tumores malignos cerebrais mais comuns em adultos e altamente resistentes às terapias convencionais. Os variantes mais frequentes e letais desta classe são denominados de glioblastomas (GBM), que apresentam uma natureza altamente invasiva e agressiva, o que os torna dificilmente tratáveis. A cura neurocirúrgica é um objetivo inatingível e, infelizmente, os GBM continuam sendo uniformemente fatais, independentemente do tratamento.Estudos moleculares recentes, com ênfase em alterações moleculares relevantes clinicamente e com potencial para o desenvolvimento de drogas, têm contribuído para um melhor entendimento patofisiológico e estratificação da doença. Em conjunto, estes trabalhos buscam colocar um pouco de ordem na heterogeneidade dos GBM e oferecem um pouco de esperança na possibilidade de tornar a abordagem terapêutica um pouco mais específica, baseada na classificação dos gliomas em subtipos moleculares. Somado a isso, a identificação de genes funcionalmente associados com a evolução dos gliomas, buscar associá-los a determinadas classes moleculares e demonstrar sua relevância clínica consistem em desafios imprescindíveis para o entendimento da doença e sua tradução em abordagem terapêutica. Esta é a proposta geral deste projeto e o foco de estudo é o gene denominado ADAM23.O gene ADAM23 é predominantemente expresso em cérebro normal e tem sua expressão gradualmente reduzida ao longo da progressão dos gliomas. O gene ADAM23, codifica para um membro cataliticamente inativo da família das ADAMs (do inglês, A Disintegrin And Metalloproteinase Family) e está frequentemente silenciado em diversos tipos de câncer. Neste projeto propomos estudar a função, os mecanismos e relevância clínica do gene ADAM23 para a progressão dos gliomas por meio da análise dos níveis de expressão de ADAM23 em amostras primárias de gliomas difusos e pelo do uso de small hairpin RNA (shRNA) em modelos celulares de neurosferas de amostras de GBM e através de sua inoculação in vivo. (AU)

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O glioblastoma multiforme (GBM) é um tumor letal e a radioterapia permanece como um dos principais tratamentos. Novas estratégias são necessárias para coibir a resistência ao tratamento, sendo que uma delas tem como base a inibição da atividade de fatores de transcrição (FTs). Há evidências de que membros da família E2F podem constituir FTs alvos promissores para a terapia anticâncer, pelo fato destes apresentarem funções relacionadas à proliferação, apoptose, invasão, ciclo celular e reparo no DNA; alguns destes (E2F1 e E2F4) já foram relatados como superexpressos em GBM, quando comparados a amostras de tecidos cerebrais normais. A sobreposição funcional das proteínas E2F pode ser sobrepujada graças ao inibidor de proteínas da família E2F (E2F1-8), conhecido por HLM006474 (HLM); esse inibidor é uma 8-hidroxi-quinolina, cujas atividades antiproliferativas e pró-apoptóticas foram demonstradas em alguns tipos de células tumorais, havendo a vantagem de que estes inibem os vários membros da família E2F. Como descrito no relatório de projeto do Dr Paulo Roberto D'Auria Vieira de Godoy (Proc. Nº 2013/13253-4, vinculado ao auxílio regular: Proc. nº 2013/09352-7), o tratamento de duas linhagens celulares de GBM (U343MG-a, U87MG), e uma linhagem de astrócitos primários (ACBRI 371) com o inibidor HLM evidenciou sensibilidades distintas das linhagens ao agente, causando acentuada redução na proliferação e, em alguns casos, induzindo apoptose e alterações no ciclo. Dessa forma, vislumbrando uma possível aplicação do HLM como monoterapia para tumores de gliomas, será realizada (nos próximos meses) a análise de expressão gênica em larga escala por microarranjos, com o objetivo de estudar os perfis transcricionais característicos de cada linhagem após o tratamento com HLM, podendo fornecer dados que permitam a compreensão dos mecanismos de sinalização molecular em resposta à intervenção como o inibidor HLM, o que é potencialmente relevante para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes para os pacientes com GBM. (AU)

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Caracterização de células-tronco tumorais de câncer de pulmão eglioblastoma multiformeResumoCélulas-tronco tumorais (CSC) representam o estado maisindiferenciado e agressivo de células malignas. As CSC são interpretadas, naliteratura, como resistentes à terapia e como tendo a habilidade de se autorenovare diferenciar nos outros tipos celulares que formam o tumor, assimdesempenhando um relevante papel na recorrência do tumor (Reya et al, 2001;Alison et al, 2011). Buscando elucidar os mecanismos pelos quais as CSCdirigem a carcinogênese, o enriquecimento dessa população de células in vitrotem sido amplamente realizado. No entanto, os métodos utilizados para oenriquecimento de CSC têm sido pouco explorados e, por vezes, apresentamresultados contraditórios acerca do efeito da composição do meio de cultivo ede diferentes substratos no enriquecimento dessas células (Molina et al, 2014).Nesse sentido, o presente projeto propõe a caracterização de células-troncotumorais de câncer de pulmão e glioblastoma multiforme. Para isso, linhagenscelulares de câncer de pulmão e glioblastoma multiforme serão cultivadasexplorando diferentes composições de meio de cultivo e diferentes substratospara cultivo aderente ou em suspensão. Em seguida, as CSC serão avaliadasquanto à expressão de marcadores de célula-tronco (CD133, Nestina, Sox-2 eALDH1) por citometria de fluxo. Paralelamente, culturas primárias de câncer depulmão e de glioblastoma multiforme serão estabelecidas no laboratório,visando validar a caracterização de CSC realizada nas linhagens. (AU)

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O sistema nervoso central (SNC) é constituído por astrócitos (50%), oligodendrócitos (40%), micróglia (5%) e células ependimárias (5%), os quais oferecem o suporte estrutural e funcional para os neurônios. Em especial os tumores da glia (glioma ou glioblastoma) estão entre as neoplasias mais comuns do SNC adulto e surgem a partir de astrócitos, oligodendrócitos e seus precursores. O glioblastoma multiformé (GBM) é o tipo mais agressivo e freqüente desses tumores. Outro problema grave que acomete o SNC é o chamado acidente vascular cerebral (AVC), o qual é causado pela redução do suprimento sanguíneo, resultando no decréscimo da oferta de oxigênio e glicose em uma área do cérebro. Um terceiro problema grave é a presença de sangue no espaço subaracnoideo devido à hemorragia meníngea, o que leva ao vasoespasmo das artérias cerebrais. Todos os tratamentos existentes atualmente para os acometimentos cerebraisaqui relatados são pouco eficazes, resultando em um grande número de pacientes com seqüelas neurológicas graves ou mortes. Por isso, existe a necessidade de desenvolver uma abordagem terapêutica mais efetiva. Este projeto está basicamente dividido em cinco subprojetos, sendo três relacionados ao glioblastoma, um relacionado ao vasoespasmo cerebral e outro referente à isquemia cerebral focal. Os estudos propostos neste projeto nos parecem de extrema relevância, visto que a utilização de novas tecnologias, em um tema já explorado, mas, com pouco sucesso, parece ser a chave para a descoberta de novas estratégias terapêuticas. Logo, a linha mestra comum que une todas as propostas é a combinação de Nanotecnologia, Fotoprocesso e Terapia Celular para o tratamento de patologias do SNC. (AU)

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Glioblastomas multiformes são um dos tumores mais agressivos e mortais para humanos. O principal quimioterápico aplicado no seu tratamento é a Temozolomida (TMZ), porém sua atividade é significativamente limitada pela ação da barreira hematoencefálica. Um material nanoestruturado que tem a extraordinária capacidade de superar esta barreira são as micelas a base do tensoativos neutros do tipo Plurônico. Em um trabalho anterior demonstramos que as micelas mistas dos Plurônicos P123/F127 são capazes de carregar e estabilizar a molécula hidrofóbica Verteporfirina para a aplicação de terapia a base de luz visível. A TMZ tem sido combinada com sucesso com fototerapias mostrando uma atuação anticancerígena sinérgica, contudo testes clínicos são ainda distantes devida a ação inibitória da barreira hematoencefálica. Portanto, encapsular ambas as drogas em nanopartículas de Plurônico, especialmente desenvolvidas para o combate de gliomas, é uma estratégia promissora. Adicionalmente os Plurônicos podem ser sinteticamente modificados a fim de inserir em sua estrutura diferentes moléculas funcionais, como sondas fluorescentes para a imagem do tumor e de agentes de direcionamento ativo para aumentar a seletividade às células alvo. Assim, no presente projeto busca-se: (i) desenvolver um sistema nanoestruturado multifuncional para o carregamento da TMZ e Verteporfina; (ii) otimizar das condições de formulação e estabilidade do formulado; (iii) demonstrar um aumento significativo atividade anticancerígena em tumores cerebrais pela associação sinérgica entre nanoparticulas multifuncionais e a terapia combinada. (AU)

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Tumores malignos do cérebro constituem uma das mais devastadoras formas de câncer humano. A capacidade de invadir o tecido nervoso saudável é uma característica dos gliomas que torna seu tratamento difícil. A via PI3K/Akt/mTOR (e a fosfatase PTEN, que inativa essa via), a via RhoA/ROCK e a bomba Na+/K+-ATPase estão envolvidas na tumorigênese, migração, invasão, crescimento e sobrevivência dos gliomas. Utilizar essas vias como alvo terapêutico é uma estratégia que pode contribuir para o tratamento dos tumores. Venenos animais são uma mistura de moléculas biologicamente ativas com alvos específicos em células e tecidos. Apesar da elevada toxicidade, essas moléculas podem ser ferramentas úteis para investigar mecanismos fisiopatológicos, bem como servir como protótipo para o desenvolvimento de novas drogas. O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) (Ctenidae, Araneomorpha) contém potentes peptídeos básicos, alguns deles neurotóxicos, os quais interferem na fisiologia de canais iônicos e na liberação e captação de neurotransmissores. Foi recentemente demonstrado pelo nosso grupo que os astrócitos são alvo direto de moléculas presentes no veneno. Em cultura primária de astrócitos, o PNV evocou ondas transientes de Ca2+ de maneira dose-dependente, alterou o citoesqueleto de actina (fibras de estresse), o balanço entre F- e G-actina, modificou a morfologia celular e aumentou a expressão da bomba Na+/K+-ATPase. Além disso, resultados recentes mostraram que o PNV aumenta a expressão da fosfatase PTEN e reduz a expressão de PI3K e Akt no tecido neural, sugerindo que o veneno inibe essa via. Portanto, identificar e caracterizar as toxinas presentes no PNV que têm os astrócitos como alvo específico pode ser útil no tratamento de tumores cerebrais do tipo glioma, os quais se originam a partir da glia. O presente trabalho tem como objetivo investigar o papel antitumoral do PNV e de suas toxinas purificadas in vitro em células de glioma NG97ht e glioblastoma U87MG e descrever o efeito e mecanismo de ação do veneno e toxinas no citoesqueleto, migração e morfologia das células tumorais, avaliando as vias PI3K/Akt/mTOR e RhoA/ROCK e o papel da Na+/K+-ATPase. O presente estudo também irá caracterizar toxina(s) isolada(s) do veneno com efeito antitumoral in vivo, em glioma e glioblastoma implantados em cérebro de camundongos. Além disso, uma vez que o PNV e suas toxinas purificadas apresentam múltiplas vias de sinalização e proteínas como alvo, tem sido complexo delinear o seu mecanismo de ação. O presente estudo utilizará análises de proteômica para avaliar uma ampla gama de possíveis alvos do veneno e das toxinas isoladas em tecido saudável e tumoral. O uso desse método poderá capturar a dinâmica de sistemas biológicos alterados, avaliando um grande espectro de proteínas. Resultados preliminares apresentados no presente projeto demonstram que o veneno tem significativa ação quimioterápica em células de glioma, sendo, portanto, promissor investigar esse efeito e seus mecanismos. O estudo, que será realizado utilizando modelos in vivo e in vitro, através de métodos morfológicos, moleculares, bioquímicos, analíticos e de imagem, irá contribuir para o desenvolvimento de novos tratamentos potenciais para tumor cerebral. (AU)

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O glioblastoma é composto por células tumorais, células do estroma tumoral e células-tronco CD133+. Relatos recentes descreveram a origem das células CD133+ de glioblastoma e sua função no microambiente tumoral. O presente trabalho buscou investigar as propriedades multipotentes e mesenquimais das células CD133+ que iniciam o glioblastoma primário. Para alcançar este objectivo, foram utilizadas as seguintes abordagens: i) geração de subspheres tumorais a partir de culturas de células primárias de glioblastoma humano; ii) Análise da expressão de marcadores de pluripotênica de células-tronco e marcadores de células-tronco mesenquimais (MSC) nas células CD133+ de glioblastoma; iii) caracterização ultra-estrutural das células CD133+, MSC e células-tronco hematopoiéticas CD133+; iv) avaliação da diferenciação adipogênica das células CD133+ glioblastoma; v) modelo experimental de glioblastoma ortotópico na ausência de imunossupressão. Descobrimos que as células CD133+ glioblastoma expressa tanto marcadores de pluripotência (NANOG, Mush-1 e SSEA-3), quanto marcadores mesenquimais. Além disso, as células CD133+ foram capazes de se diferenciar em células adipogênicas. A microscopia electrônica de transmissão (TEM) demonstrou que as células-tronco CD133+ de glioblastoma apresentavam características ultra-estruturais semelhantes às das MSCs indiferenciadas. Além disso, quando administrado em modelo experimetnal em animais não imunocomprometidos, as células CD133+ também foram capazes de reproduzir o fenótipo tumoral, o qual lhe deu origem. Em resumo, a célula CD133+ de glioblastoma expressa assinatura molecular de MSC, células-tronco neurais e células-tronco pluripotentes, permitindo, assim, possivelmente, a diferenciação em ambos os tipos de células neuronais e mesodermais. (AU)

Papel funcional da enzima LOXL3 em astrocitomas

Processo:16/05777-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência: 01 de agosto de 2016 - 31 de julho de 2018
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina
Pesquisador responsável:Sueli Mieko Oba Shinjo
Beneficiário:
Instituição-sede: Faculdade de Medicina (FM). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo, SP, Brasil
Assunto(s):GlioblastomaExpressão gênicaNeurologia
Resumo

Os astrocitomas são tumores que acometem as células astrocíticas do sistema nervoso central e são os tumores mais frequentes dentre os gliomas (tumores associados às células gliais). Nos Estados Unidos eles ocupam 34% do total de subtipos morfológicos de gliomas e no Brasil também são os mais comuns, acometendo principalmente os homens. A organização mundial de saúde classifica os astrocitomas de acordo com sua malignidade, sendo o grau I ou astrocitoma pilocítico (AP) de baixo grau e o grau IV, ou glioblastoma (GBM) o mais maligno e com o pior prognóstico. Nosso laboratório comparou os genes em hiperexpressão em GBM em relação ao AP, com objetivo de identificar novos alvos terapêuticos. O gene da enzima lisil oxidase (LOX) foi um dos encontrados em hiperexpressão em GBM. A enzima LOX pertence a uma família com cinco membros (LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4) e atua na catalisação das ligações cruzadas no colágeno e na elastina. Dentre os membros da família LOX, a enzima LOXL3 foi a única que teve um impacto no prognóstico dos casos com GBM: pacientes com hiperexpressão de LOXL3 apresentam uma menor média da sobrevida em relação aos que apresentam o gene hipoexpresso. LOXL3 já foi identificado como possível colaborador da migração celular e metástase, através do seu envolvimento com o gene responsável pela regulação da transição epitélio-mesenquimal, Snail. Este presente estudo tem como objetivo investigar o papel funcional de LOXL3 como um potencial alvo terapêutico no tratamento de GBM. (AU)

Resumo

Tumores malignos do cérebro constituem uma das mais devastadoras formas de câncer humano. A capacidade de invadir o tecido nervoso saudável é uma característica dos gliomas que torna seu tratamento difícil. A via PI3K/Akt/mTOR (e a fosfatase PTEN, que inativa essa via), a via RhoA/ROCK e a bomba Na+/K+-ATPase estão envolvidas na tumorigênese, migração, invasão, crescimento e sobrevivência dos gliomas. Utilizar essas vias como alvo terapêutico é uma estratégia que pode contribuir para o tratamento dos tumores. Venenos animais são uma mistura de moléculas biologicamente ativas com alvos específicos em células e tecidos. Apesar da elevada toxicidade, essas moléculas podem ser ferramentas úteis para investigar mecanismos fisiopatológicos, bem como servir como protótipo para o desenvolvimento de novas drogas. O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) (Ctenidae, Araneomorpha) contém potentes peptídeos básicos, alguns deles neurotóxicos, os quais interferem na fisiologia de canais iônicos e na liberação e captação de neurotransmissores. Foi recentemente demonstrado pelo nosso grupo que os astrócitos são alvo direto de moléculas presentes no veneno. Em cultura primária de astrócitos, o PNV evocou ondas transientes de Ca2+ de maneira dose-dependente, alterou o citoesqueleto de actina (fibras de estresse), o balanço entre F- e G-actina, modificou a morfologia celular e aumentou a expressão da bomba Na+/K+-ATPase. Além disso, resultados recentes mostraram que o PNV aumenta a expressão da fosfatase PTEN e reduz a expressão de PI3K e Akt no tecido neural, sugerindo que o veneno inibe essa via. Portanto, identificar e caracterizar as toxinas presentes no PNV que têm os astrócitos como alvo específico pode ser útil no tratamento de tumores cerebrais do tipo glioma, os quais se originam a partir da glia. O presente trabalho tem como objetivo investigar o papel antitumoral do PNV e de suas toxinas purificadas in vitro em células de glioma NG97ht e glioblastoma U87MG e descrever o efeito e mecanismo de ação do veneno e toxinas no citoesqueleto, migração e morfologia das células tumorais, avaliando as vias PI3K/Akt/mTOR e RhoA/ROCK e o papel da Na+/K+-ATPase. O presente estudo também irá caracterizar toxina(s) isolada(s) do veneno com efeito antitumoral in vivo, em glioma e glioblastoma implantados em cérebro de camundongos. Além disso, uma vez que o PNV e suas toxinas purificadas apresentam múltiplas vias de sinalização e proteínas como alvo, tem sido complexo delinear o seu mecanismo de ação. O presente estudo utilizará análises de proteômica para avaliar uma ampla gama de possíveis alvos do veneno e das toxinas isoladas em tecido saudável e tumoral. O uso desse método poderá capturar a dinâmica de sistemas biológicos alterados, avaliando um grande espectro de proteínas. Resultados preliminares apresentados no presente projeto demonstram que o veneno tem significativa ação quimioterápica em células de glioma, sendo, portanto, promissor investigar esse efeito e seus mecanismos. O estudo, que será realizado utilizando modelos in vivo e in vitro, através de métodos morfológicos, moleculares, bioquímicos, analíticos e de imagem, irá contribuir para o desenvolvimento de novos tratamentos potenciais para tumor cerebral. (AU)

Resumo

Evidências indicam que a neuroinflamação está intrinsicamente associada ao papel causal e exacerbativo das doenças neurodegenerativas. Como célula residente do sistema imune no sistema nervoso central (SNC), a microglia atua como elemento sensitivo e como a primeira linha de defesa contra estímulos pró-inflamatórios. A liberação de níveis patológicos de substâncias citotóxicas, como detritos extracelulares, níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias com concomitante estresse oxidativo em conjunto com fatores de ativação e recrutamento da microglia dão suporte ao seu papel em doenças neurodegenerativas. Embora tenha sido originalmente descrita como supressor tumoral, a PTEN (phosphatase and tensin homolog), tem sido objeto de estudo de pesquisas relacionadas a processos celulares como crescimento, proliferação, sobrevivência, metabolismo e migração celular, com um potencial papel modulatório sobre a neurogênese, a plasticidade sináptica e, mais recentemente, a inflamação. A localização da PTEN pode ser tanto citoplasmática quanto nuclear e suas funções parecem depender de sua compartimentalização na célula.Este projeto focará no papel da PTEN sobre a neuroinflamação e tem como objetivo estudar os possíveis efeitos da compartimentalização (núcleo/citoplasma) da PTEN frente à inflamação induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS) na linhagem U87MG, derivada de glioma humano.O melhor entendimento do envolvimento da PTEN nas vias ou mecanismos moleculares direta ou indiretamente envolvidos na neuroinflamação podem levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para tratamentos mais eficazes contra doenças associadas à deleção e mutação da PTEN, neuroinflamação e às doenças neurodegenerativas. Como estudo prioneiro nesta área, os dados obtidos deste estudo serão de grande impacto para a área da neurociência e para o tratamento de doenças neuropsiquiátricas. (AU)

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A família da "ribosomal protein S6 kinase" (RSKs) é constituída por quatro isoformas em humanos (RSK1 - 4), que são reguladas diretamente pela via de Ras-ERK1/2. As RSKs regulam diferentes funções, como proliferação e controle da transcrição e tradução. A desregulação das RSKs parece ser responsável por diferentes processos oncogênicos em diversos tipos tumorais. Contudo, a função das RSKs em glioblastomas (GBM) ainda não foi descrita. O GBM é o tumor do cérebro mais comum e apresenta altas taxas de mortalidade devido a sua agressividade e baixas respostas aos tratamentos disponíveis atualmente, sendo o tempo de sobrevida menor do que dois anos. Deste modo, descrever as vias de sinalização alteradas e as funções que regulam nos GBMs é essencial para compreender o comportamento a nível molecular deste tipo tumoral, o que pode levar ao desenvolvimento de terapias mais efetivas. Por isso, pretende-se estudar os processos envolvidos na tumorigênese de GBMs que são regulados via RSKs. O presente projeto terá como foco a avaliação do papel das RSKs no controle da tradução de mRNAs em GBMs e as vias de sinalização moduladas pela ativação das RSKs e que possivelmente estejam alteradas em GBMs. Este projeto envolverá a utilização de células nocautes para as RSKs geradas através da técnica de CRISPR-Cas9. Como o principal mediador do controle da tradução dependente das RSKs é mTORC1, estudaremos a regulação desta via e seu efeito nos níveis de tradução. Pretendemos também identificar mRNAs traduzidos de maneira dependente de RSKs através de translatômica. Com isso, contribuiremos para construir uma base sólida para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para GBMs. (AU)

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O Glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo de tumor mais comum e letal do sistema nervoso central. As células-tronco tumorais de GBM (GSCs) representam o estado mais indiferenciado e agressivo das células de GBM, sendo postulado que são as responsáveis pela após a terapia padrão. A complexa heterogeneidade intra-tumoral de GBMs evidencia a contribuição de diferentes tipos celulares, como as células-tronco neurais e seus derivados na gênese deste tumor. A proteína RECK canônica suprime a invasão celular, angiogênese e metástase, porém seu mecanismo de ação não é totalmente claro. Para entender a complexidade dos padrões de expressão de Reck, suas variantes geradas por splicing alternativo foram isoladas e caracterizadas em nosso grupo, tendo sido observado que o balanço entre a expressão destes transcritos apresenta potencial informativo para o prognóstico de GBM. Surpreendentemente, o estudo funcional de uma das variantes, RECK-B, sugere que esta isoforma apresenta atividade pró-oncogênica. A depleção de Reck leva à neurodiferenciação precoce durante o desenvolvimento embrionário através da modulação da via de Nocht, e sua expressão é maior no giro denteado murino adulto, dando origem a hipóteses sobre o papel de RECK na manutenção do estado indiferenciado de células-tronco neurais (NSCs-neural stem cells) ou no comprometimento para diferentes vias de diferenciação. Através de meta-análise, nossos resultados preliminares mostram que a expressão de Reck, sem distinção entre a representatividade de suas variantes, é inesperadamente maior em células tumorais CD133+. Neste contexto, a proposta deste trabalho é avaliar a influência de RECK e RECK-B em NSCs normais e seus derivados, no processo tumorigênico de GBMs e, conseqüentemente, no comportamento de GSCs. (AU)

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O câncer é uma doença crônica que ocorre devido ao crescimento desordenado das células. A doença compreende os gliomas, tumores cerebrais originados das células da glia. Os tratamentos mais utilizados para combater esses tumores, além das cirurgias, são a quimioterapia e a radioterapia. Apesar do efeito considerável na redução do número de células cancerosas, em alguns casos ocorrem falhas devido à capacidade adquirida por essas células de diminuir os níveis de concentração citoplasmáticos de diversas drogas administradas, favorecendo assim a resistência celular. Dentro deste contexto, observa-se a atuação dos ácidos graxos poli-insaturados em diferentes células resistentes aumentando a permeabilidade celular e permitindo a ação eficiente do tratamento, indicando que além da atividade isolada na diminuição da proliferação celular, através da apoptose, os ácidos graxos podem auxiliar a ação dos quimioterápicos em células resistentes impedindo o crescimento tumoral. Por esse motivo, o propósito principal do estudo é analisar o papel dos ácidos graxos ômega 3 e ômega 6 em células de glioma humano e glioma de rato in vitro sensíveis e resistentes a múltiplas drogas a fim de verificar os efeitos no crescimento tumoral e na ação quimioterápica observando posteriormente a atividade da combinação das drogas e ácidos graxos no tratamento in vivo. (AU)

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Os compostos de rutênio têm recebido grande atenção na área de metalofármacos pelo seu potencial como agentes anticancerígenos. Complexos contendo o centro dimetálico Ru2(II,III)coordenados a fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (FAINEs)desenvolvidos no nosso grupo de pesquisa, tem mostrado resultados promissores em estudos in vitro e in vivo em modelos de glioma, como o glioblastoma multiforme, um câncer de cérebro altamente maligno. O principal objetivo para esse projeto de estágio sanduiche é investigar a viabilidade de desenvolver sistemas de nanopartículas lipídicas contendo os complexos Ru2(II,III)-FAINEs objetivando o carregamento e liberação sustentada dos metalofármacos no cérebro. As nanopartículas lipídicas desenvolvidas pelo grupo da Dra. Wu, como as nanopartículas lipídio-terpolimero, foram capazes de atravessar a barreira hemato encefálica, mostrando, assim, um potencial no tratamento de gliomas e permitindo, entre outras coisas, aumentar a biodisponibilidade intracelular e intratumoral da droga e diminuir a toxicidade sistêmica das drogas antitumorais. Nesse contexto, os principais objetivos desse plano são 1) desenvolver metodologia para a preparação das nanopartículas lipídicas, como Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLSs) e nanopartículas lipídio-terpolimero, contendo os metalofármacos; 2) caracterizar as nanopartículas híbridas usando diversas técnicas; 3) investigar a viabilidade de liberação dos metalofármacos dos sistemas híbridos; 4) realizar estudos in vitro para verificar o potencial de aplicação dos novos sistemas aos tratamentos anticancerígenos. (AU)

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Gliomas são a forma mais comum de malignidades primárias. Gliomas de alto grau, também chamados de glioblastoma, são os mais frequentes, apresentando o pior prognóstico (expectativa de vida de 12 meses após o diagnóstico). Terapia para tumores cerebrais são limitadas pela ausência de métodos efetivos de drug delivery, portanto, é imperativa a busca por novas abordagens no desenvolvimento da terapia de gliomas. Um estudo prévio do nosso grupo revelou que a superexpressão de cDNA de Ectodermal-Neural Cortex 1 (ENC 1) em células de glioma de rato (C6/ST1) resultou em significativa redução do potencial de crescimento em soft agar e tumorigênese in vivo. ENC1 tem duas isoformas proteicas: uma de 67kDa (Longer) e uma de 57 kDa (Shorter). A Shorter foi identificada em neurônios primários, porém não foi caracterizada ainda. Peptídeos e proteínas que podem ser internalizados por células tem sido alvo de intenso estudo nos recentes anos, já que translocação pela membrana é critico em drug delivery e terapia gênica. Este projeto tem dois objetivos. Primeiramente, caracterizar o potencial das isoformas de ENC1 em suprimir o fenótipo tumorigênico, como previamente observado e identificar peptídeos capazes de serem internalizados por glioblastoma humano. (AU)

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Os gliomas, incluindo glioblastoma que é o tumor intracraniano mais letal, exibem um desenvolvimento muito complexo, que pode levar à resistência ao tratamento e recidiva. Esta heterogeneidade pode interferir no diagnóstico e, consequentemente, na abordagem terapêutica. Atualmente, os gliomas são classificados com base na histologia e então classificados em um grau que varia de I a IV, dependendo da malignidade do tumor. No entanto, as características histológicas são geralmente inferidas pela observação visual de uma amostra biológica extraída do tumor, o que pode causar discrepâncias de diagnóstico entre os patologistas. Este cenário vem mudando nos últimos anos, com atualizações constantes na caracterização molecular dos gliomas e o avanço de tecnologias que permitem a aplicação e execução destes resultados na clínica médica. O mais recente estudo sobre o panorama genômico e epigenômico dos gliomas identificou um subgrupo distinto de amostras com mutação nos genes IDH que possuem um prognóstico abaixo do esperado. Este subtipo (GCIMP-low) é caracterizado por uma perda de metilação do DNA, com base em dados de array (Illumina HumanMethylation27 e HumanMethylation450), quando comparado com outras amostras com mutação nos genes IDH, que também não possuem codeleção nos cromossomos 1p e 19q (GCIMP-high). A proposta deste trabalho consiste em analisar as mudanças em todo o epigenoma dos subtipos GCIMP-low e GCIMP-high a fim de identificar regiões candidatas que estão desreguladas, permitindo assim a compreensão de mecanismos de progressão entre amostras de glioma com mutação nos genes IDH. As amostras de glioma serão adquiridas e pré-processadas utilizando ferramentas desenvolvidas pelo nosso grupo, como o TCGAbiolinks (um pacote R/Bioconductor). Dados epigenômicos complementares, como elementos reguladores já descritos na literatura e amostras de ChIP-seq, provenientes de bases de dados externas (TCGA, ENCODE e Roadmap), gerados a partir de amostras de cérebro não tumoral e de tumores cerebrais, serão obtidos com o desenvolvimento de uma nova ferramenta chamada biOMICs+, que permitirá a integração de dados obtidos de diferentes fontes. As redes de regulação que propomos identificar neste projecto serão anotadas, com base nos perfis de metilação do DNA e expressão gênica de amostras de glioma, e caracterizadas para expandir o conhecimento da base molecular de tumores, especialmente gliomas, com o objetivo de entendermos os mecanismos relacionados com a iniciação e progressão dos cânceres cerebrais. (AU)

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Dados prévios de nosso grupo indicam que genes envolvidos na sinalização do dano e na execução do reparo de DNA estão consistentemente superexpressos em glioblastomas multiformes (GBMs), os tumores cerebrais primários mais frequentes e agressivos. O processo de desenvolvimento tumoral é marcado pela proliferação celular descontrolada que está associada ao acúmulo de mutações, que podem surgir espontaneamente ou por exposição a agentes lesivos ao DNA (radiação UV, espécies reativas de oxigênio). Dados recentes da literatura e do nosso grupo sugerem que o aumento na competência para corrigir lesões no DNA pode estar associado com a progressão do câncer, conferindo maior resistência, estabilidade genômica e capacidade proliferativa para as células tumorais. Logo, a caracterização da função de genes de reparo na manutenção da estabilidade genômica e capacidade proliferativa destas células é extremamente importante para melhorar o entendimento da progressão tumoral e fornecer subsídios para o desenvolvimento de novas terapias. Desse modo, neste projeto pretendemos confirmar a super-expressão de um conjunto de genes de reparo de DNA em linhagens celulares de GBM e investigar se sua função é requerida para a manutenção da estabilidade genômica destas células. (AU)

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Os astrocitomas estão entre os tumores mais comuns do sistema nervoso central e são classificados de acordo com seu grau de malignidade em uma escala de I a IV, considerando características histológicas e alterações genéticas do tumor. O grau IV ou glioblastoma (GBM) é o mais frequente e maligno e o tratamento padrão consiste em ressecção cirúrgica do tumor seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolamida. Mesmo com este tratamento agressivo, a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente 1 ano. Na expectativa de aumentar a sobrevida do paciente busca-se combinar a terapia padrão com outras terapias de base biológica. Para tanto diversos estudos têm sido desenvolvidos na busca por proteínas de membrana expressas em diferentes tipos de tumores, inclusive GBM, que poderiam servir como alvos terapêuticos. Entre estes está o CD99, uma proteína expressa na membrana de células hematopoiéticas e outros tipos celulares que desempenha papel na diferenciação, adesão e migração de linfócitos T e B. O CD99 também foi descrito em diversos tipos de tumores, incluindo sarcoma e GBM. Nosso laboratório demonstrou níveis elevados de RNA mensageiro e da proteína em amostras de tecido e linhagens de GBM. Um estudo detalhado da função de CD99 será realizado através da análise do transcriptoma de linhagens celulares de GBM (U87MG e A172) silenciadas e não-silenciadas para a expressão de CD99, a fim de identificar vias de sinalização moduladas por CD99. A análise do transcriptoma direcionará os estudos funcionais a serem realizados para comprovação dos achados. Adicionalmente, a capacidade tumorigênica das linhagens silenciadas será avaliada in vivo. (AU)

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Gliomas, os tumores cerebrais primários mais frequentes em adultos, são classificados histologicamente em graus I-IV, sendo que os glioblastomas (grau IV) são altamente proliferativos e invasivos e estão associados a uma taxa média de sobrevivência de 15 meses. Estudos in vitro demonstraram que o tratamento com concentrações elevadas de melatonina, hormônio produzido circadianamente pela glândula pineal, reduz a migração e invasão celular de linhagens de glioma. Adicionalmente, em estudo preliminar, evidenciamos uma expressão reduzida do gene que codifica a última enzima da via de biossíntese de melatonina (acetilserotonina O-metiltransferase, ASMT) por glioblastomas, em comparação ao tecido cerebral não-neoplásico e aos gliomas de menor grau. Com base nesses dados, durante minha Iniciação Científica (IC), demonstramos que a habilidade das linhagens de glioma humano HOG, T98G e U87MG de produzir melatonina é inversamente proporcional ao grau de invasibilidade/agressividade tumoral; sendo que a linha-gem mais agressiva (U87MG) apresentou a maior expressão de citocromo P450 1B1 (CYP1B1), gene que codifica a principal enzima de fase I de metabolização de melatonina no sistema nervoso central. Dessa forma, no presente projeto avaliaremos a hipótese de que o sistema melatonérgico dos gliomas humanos está implicado na determinação do grau de invasibilida-de/agressividade tumoral. Para tanto: i) realizaremos a caracterização do sistema melatonérgico de linhagens de glioma humano com diferentes graus de invasibilidade/agressividade (iniciada em minha IC) e de biópsias de gliomas humanos; ii) avaliaremos a implicação da melatonina produzida pelos gliomas sobre diferentes aspectos do desenvolvimento e progressão tumoral. Trata-se de um estudo relevante pois, além de caracterizar alterações da fisiologia celular associadas a um fenótipo tumoral mais invasivo/agressivo, também poderá ser base para abordagens terapêuticas que considerem a utilização da melatonina e análogos como adjuvantes no tratamento de gliomas. (AU)

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As RSKs (RSK1-4) são um grupo de quinases reguladas diretamente pela via de Ras-ERK1/2. Em vários tipos tumorais, as RSKs estão envolvidas com importantes funções, como proliferação, e controle da transcrição e tradução. No entanto, descrevemos que os dois inibidores químicos mais usados para RSK (SL0101 e BI-D1870) são inespecíficos, gerando a necessidade de uma reavaliação das funções descritas para as RSKs. Até o momento nada se conhece da função das RSKs em glioblastomas (GB). O (GB) é o tumor do cérebro mais comum e apresenta altas taxas de mortalidade. Com os tratamentos disponíveis atualmente, o tempo de sobrevida é menor que dois anos. Deste modo, conhecer melhor as vias de sinalização alteradas nos GBs é essencial para o desenvolvimento de terapias mais efetivas. Resultados preliminares do nosso grupo sugerem uma grande heterogeneidade na expressão das RSKs, tanto em casos de GB como em linhagens celulares. Também, observamos uma correlação entre os níveis da proteína RSK1 e PTEN, sendo que alterações de PTEN são frequentes nos GBs. Dessa maneira pretendemos analisar como as RSKs regulam vários processos envolvidos na tumorigênese. Será dada especial importância a avaliação do papel das RSKs no controle da tradução de mRNAs pelas RSKs, um processo no qual ainda existem dúvidas respeito ao papel das RSKs. Baseado numa possível relação entre RSK e PTEN, buscaremos definir o efeito das RSKs no processo de senescência induzido pela perda de PTEN. Assim, pretende-se contribuir para o avanço no conhecimento dos mecanismos moleculares que regulam a biologia dos GBs, construindo assim uma base sólida para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. (AU)

Estudo de genes preditores de radiossensibilidade e sobrevida em pacientes com glioblastoma tratados com radioterapia e temozolamida

Processo:15/20973-9
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de fevereiro de 2016 - 31 de janeiro de 2018
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
Pesquisador responsável:Fernanda Maris Peria
Beneficiário:
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto, SP, Brasil
Pesq. associados:

Antonio Carlos Cavalcante Godoy ; Carlos Gilberto Carlotti Júnior ; Daniel Antunes Moreno ; Daniela Pretti da Cunha Tirapelli

Assunto(s):RadiossensibilidadeOncologiaExpressão gênicaRadioterapia
Resumo

INTRODUÇÃO: O glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor primário do sistema nervoso central mais frequente no adulto, com sobrevida média de aproximadamente 12 meses. Múltiplas alterações genéticas e epigenéticas presentes neste tumor determinam sua biologia e fenótipo bastante agressivos. O tratamento padrão do GBM é uma abordagem multidisciplinar, envolvendo neurocirurgia, radioterapia (RT) e quimioterapia (QT). As melhores taxas de resposta e sobrevida dos pacientes com diagnóstico de GBM têm sido associadas ao tratamento combinado de cirurgia (com máxima ressecção possível), seguida de RT associada à Temozolamida (TMZ) em caráter radiossensibilizante seguido de TMZ adjuvante.Diversos estudos têm avaliado assinaturas de expressão gênica capazes de predizer o comportamento clínico e biológico de diversas neoplasias. Em estudos experimentais envolvendo culturas de células de linhagens através de análises gênicas em larga escala, foi possível identificar 10 genes (AR, cJun, STAT1, PKC, RelA, c-Abl, SUMO1, CDK1, HDAC1 e IRF1) associados a radiossensibilidade, criando um coeficiente denominado Índice de Radiossensibilidade (RSI). Este coeficiente foi validado para tumores de reto, esôfago, tumores de cabeça e pescoço e mama tratados com radioterapia associados ou não a quimioterapia, entretanto, estudos semelhantes ainda não foram realizados considerando amostras de glioblastoma multiforme primário.OBJETIVOS: O objetivo deste trabalho é estudar a expressão dos genes envolvidos no RSI e do gene MGMT em amostras de tumor primário humano de GBM, buscando identificar a associação destes com radiossensibilidade e sobrevida.PACIENTES E MÉTODOS: As análises da expressão relativa dos genes AR, cJun, STAT1, PKC, RelA, c-Abl, SUMO1, CDK1, HDAC1, IRF1 e MGMT serão realizadas utilizando-se a técnica de PCR em tempo real. Serão coletadas informações contidas no prontuário médico do paciente relacionadas às características clínicas, epidemiológicas, sócio demográficas e de evolução clínica e radiológica (toxidades, pseudoprogressão tumoral e resposta tumoral) e desfecho clínico (sobrevida global, sobrevida livre de progressão e taxas de sobrevida em 6 meses e 12 meses após o diagnóstico). Considerando-se um nível de significância de 5% e o poder do teste de 80%, serão analisados 90 pacientes, a serem divididos, após análise de sobrevida, em radiossensíveis e radiorresistentes. Serão comparados nestes dois grupos a expressão diferencial do RSI / MGMT. A associação das variáveis qualitativas categóricas e expressão gênica será feita pelo teste de Mann-Whitney. A análise de sobrevida será realizada pelo método não-paramétrico de Kaplan-Meier. O efeito da interação entre a marcação do RSI / MGMT com as variáveis de interesse será avaliado através do modelo de regressão logística. (AU)

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As células-tronco tem atraído grande interesse devido à sua capacidade migratória (homing) e pesquisas anteriores foram feitas sobre a sua utilização para a entrega da droga associada à terapia gênica, principalmente na terapia anticâncer e medicina regenerativa. A utilização de células-tronco para a entrega do fator de necrose tumoral relacionado ao ligante indutor de apoptose (TRAIL) é uma abordagem nova e promissora em modelos animais para o tratamento de tumores cerebrais resistentes à quimioterapia e à radioterapia. Neste contexto, o Dr. Jeronimo Blanco acumulou uma experiência considerável na utilização de células mesenquimais estromais, para a terapia de tumores e técnicas avançadas para avaliar o seu efeito sobre a regressão do tumor. Dr. Blanco vem liderando um grupo de pesquisa no Departamento de Nanotecnologia Química e Biomolecular do Instituto de Química Avançada da Catalunha (iQAC), Barcelona, Espanha desde 1990, com a publicação científica em periódicos de grande JCR. Além disso, o pesquisador orientou uma série de projetos com o apoio financeiro relacionado com as células-tronco para a entrega de drogas que afetam o crescimento do tumor. A supervisão do pesquisador nesta colaboração ajudará a fornecer aprendizado adicional e melhoria para o candidato de doutorado nas áreas de (1) Cultivo celular (CTMs e células tumorais), (2) Caracterização de CTMs (diferenciação celular e imunofenotipagem por citometria de fluxo (CF)), (3) Criopreservação, (4) Construção e validação de vetores lentivirais para a terapia gênica, (5) CF baseada em separação celular (6) Detecção de fatores solúveis no meio condicionado (8), Estudo do homing celular em modelo animal utilizando técnicas de bioluminescência avançada. É interessante notar que algumas destas técnicas, tais como, caracterização celular, criopreservação, separação celular e detecção de fatores solúveis no meio condicionado serão extremamente valiosas para utilização na atual proposta de doutorado corrente à medida que se sobrepõem com a estratégia da tese experimental e vai ajudar a resolver algumas dificuldades técnicas encontradas. A experiência com o treinamento científico irá contribuir para a melhoria da qualidade e internacionalização do nosso trabalho atual e futuro. Adicionalmente, a supervisão do Dr. Jeronimo Blanco, a colaboração de sua equipe e a excelente infra-estrutura da (iQAC) contribuirá diretamente para melhorar as habilidades técnicas da estudante de doutorado que espera obter resultados mais precisos na pesquisa atual no Brasil. Além disso, a aprendizagem da utilização da modificação genética de CTMs (técnica de DNA recombinante com genes de interesse, por exemplo, TRAIL) e procedimentos para avaliação precisa de seu potencial migratório ex vivo e in vivo irá abrir novas perspectivas para a realização de inúmeros estudos em nosso laboratório, com colaborações diretas com outros grupos de pesquisa particularmente no estado de São Paulo, para a terapia de vários distúrbios em Medicina Veterinária, com possibilidade futura de extrapolação dos resultados, incluindo Medicina humana. (AU)

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Glioblastoma multiforme é o mais comum e letal dos tumores derivado das células gliais do sistema nervoso central. RECK suprime a invasão tumoral por regular negativamente três membros da família das metaloproteinase de matriz: MMP-2, MMP-9 e MMP-MT1. Foi observada uma correlação positiva entre a abundância de expressão de RECK em amostras de tumor e um prognóstico mais favorável para pacientes com diversos tipos de tumores. No presente estudo, novas variantes de splicing alternativo do gene RECK: RECK-B e RECK-I foram isolados por RT-PCR e sequenciados. Os níveis de expressão e os perfis destes transcritos alternativos de RECK, bem como a variante canônica, foram determinados em amostras de astrocitomas de diferentes graus, além de um painel de tecidos normais de RNA por qRT-PCR. Nossos resultados sugerem que, não só a maior expressão de RECK canônico, mas também uma maior abundância da variante canônica em relação ao transcrito alternativo correlacionam-se positivamente com uma maior taxa de sobrevida global após o tratamento quimioterápico de pacientes com GBM. Células U87MG e T98G super-expressando a variante alternativa RECK-B exibiram maior crescimento clonal independente de ancoragem e não apresentam modulação da expressão de MMP-2 e MMP-9. Nossos resultados sugerem que as variantes transcricionais de RECK podem ter papéis opostos na biologia do GBM e a relação entre seus níveis de expressão pode ser informativa para o prognóstico de pacientes com GBM. (AU)

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Peptídeos internalizados por células (Cell-penetrating peptides - CPP) são considerados, em conjunto, um sistema minimamente citotóxico, que tem grande potencial para promover um eficaz transporte de fármacos para o interior das células.A principal aplicação de CPPs é a internalização de proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos ou compostos sintéticos para dentro de uma célula alvo, visando o diagnóstico, o tratamento e à prevenção de certas doenças, como câncer, diabetes, doenças cutâneas e outras.A tecnologia de Phage Display tem sido utilizada in vitro e in vivo para a identificação de ligantes peptídicos específicos de diferentes tipos celulares. Através dos inúmeros peptídeos presentes em uma biblioteca de bacteriófagos, essa técnica permite a identificação de peptídeos que se liguem, especificamente, a um(a) determinado(a) tipo de órgão, tecido ou população celular.Após três ciclos de biopanning por Phage Display em células U-87MG, U-251 e A-172 de glioblastoma humano, foram encontrados peptídeos promissores quanto à capacidade de serem internalizados. Neste projeto, visa-se validar estes peptídeos por meio de ensaios de internalização celular. (AU)

Resumo

Glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor cerebral primário maligno mais comum. Pacientes com GBM tem uma média de sobrevivência de aproximadamente 14 meses. Devido à natureza patológica e clínica heterogênea do GBM, há muitas tentativas recentes para melhor entender e caracterizar esses tumores em nível genético e molecular. O objetivo deste projeto é identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em microRNAs (miRNAs) como fator de risco para o GBM. Para realizar tal objetivo, será realizada, pela primeira vez, uma análise global de cerca de 278.000 SNPs localizados em regiões de miRNAs, em 80 amostras de DNA coletadas a partir de tecido tumoral preservados em parafina de pacientes com GBM ao diagnóstico e 80 amostras de DNA coletadas a partir de tecido cerebral normal de indivíduos submetidos a cirurgia para remoção de tumor cerebral, utilizando o Axiom® miRNA Target Site Genotyping Array (Affymetrix). Em seguida, será realizada uma seleção dos SNPs em miRNAs relevantes no GBM em comparação com as amostras de tecido cerebral normal. Após a seleção de SNPs em miRNAs candidatos como fator de risco para a doença, a influência dos diferentes genótipos (homozigoto selvagem, heterozigoto e homozigoto variante) serão validados por meio da PCR em tempo real quantitativo (qPCR) em outras 200 amostras de RNA a partir de tecido tumoral preservado em parafina de pacientes com GBM ao diagnóstico. Também, a qPCR será realizada em amostras de RNA extraídas a partir de dez amostras de culturas primárias derivadas de tecido tumoral fresco obtidos de pacientes com GBM ao diagnóstico e de 60 amostras de tecido tumoral congelados e coletados de pacientes com GBM ao diagnóstico, após cirurgia. Amostras de RNA coletadas a partir de tecido cerebral normal de indivíduos submetidos a cirurgia para remoção de tumor cerebral servirão como controle. Após o estudo da influência dos diferentes genótipos no precursor dos miRNAs acima selecionados, um miRNA relevante e cuja função não foi ainda definida em estudos posteriores, será selecionado para estudos funcionais. Será possível testar até onde o miRNA selecionado poderia ligar-se a região não traduzida (UTR) do mRNA de seu gene predito como alvo (TargetScan). Será possível também verificar o impacto do SNP na expressão do miRNA selecionado e na expressão de seu gene-alvo predito. (AU)

Resumo

A geração de neurônios e células da glia durante o desenvolvimento embrionáriocompreende uma série de redes e mecanismos de controle complexos cada vez maisestudados. São inúmeros os mecanismos celulares intrínsecos (como regulaçãotranscricional, ciclo celular, vias de sinalização interna) e extrínsecos (fatores solúveis,moléculas sinais secretadas por células vizinhas, matriz extracelular, etc.) que irãoregular o balanço entre a autorrenovação, proliferação, migração e processos dediferenciação das células-tronco embrionárias (CTEs). O microambiente dessascélulas é então, em grande parte, o responsável pelas alterações fenotípicas egenéticas observadas ao longo da proliferação e diferenciação neural. STI1 secretadajá foi encontrada no meio condicionado de vários tipos celulares como astrócitos,células-tronco neurais, microglia e glioblastoma, portanto, é um componentecaracterístico do microambiente celular. Trabalhos demonstram que processos como aautorrenovação de células-tronco pelo controle da expressão de genes depluripotência, proliferação, diferenciação neural, e neuritogênese requerem a interaçãoda PrPc com a STI1, que em parceria modulam positivamente a autorrenovação dascélulas precursoras neurais. Dado a tamanha importância dos processos realizadospela interação entre PrPc e STI1, assim como a secreção desta última proteína porvários tipos celulares característicos, esse estudo é destinado a investigar o perfil desecreção e papel da STI1 durante a diferenciação neuronal de precursores neuraisderivados de células-tronco embrionárias. (AU)

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