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Resumo

Contexto e objetivo:O queloide é uma lesão fibrosa dérmica que cresce além da margem da cicatriz original, por um longo período de tempo; geralmente não regride espontâneamente e pode apresentar recidiva após o tratamento. Aparece principalmente após traumas na pele por diversos agentes, como por exemplo após colocação de brinco ou piercing na orelha, no abdome após histerectomia ou cesariana e no tórax após mastectomia ou cirurgia cardíaca. Ainda não existe um tratamento apropriado para o queloide,além disso essa doença afeta a qualidade de vida das pessoas, por isso o conhecimento de sua formação e características moleculares e gênicas são tão necessárias. Estudo recentes afirmam que o queloide é uma desordem multifatorial envolvendo fatores nutricionais, bioquímicos, imunológicos e genéticos que exercemum papel no processo anormal de cicatrização, além da ação de citocinas e fatores de crescimento queestão envolvidos nos processos inflamatórios e cicatriciais de formação do queloide, assim como também especies radioativas de oxigênio (EROs) que são causadores de apoptose e de senescência, e queprovocariam que as células não respondam de maneira adequada aos sinais químicos, estímulos decrescimentos alterando suas características citológicas, bioquímicas e gênicas . Assim, o presente estudovisa conhecer a expressão gênica de 84 genes marcadores do estresse oxidativo por meio do método deqPCR array em queloides. Foi elaborada a hipótese de utilizar este método em pacientes com queloide emáreas específicas, como lóbulo da orelha, virgens de tratamento em comparação ao grupo controle. Essemétodo tem a finalidade de construir um perfil de genes expressos em cada grupo de pacientes, construirredes de genes expressos, guiar possíveis intervenções clínicas e permitir o desenvolvimento de estudosfuturos para possibilitar melhores perspectivas no tratamento clínico do paciente com queloide.Métodos:Serão incluídos 10 pacientes com queloides na região do lóbulo da orelha que conformará o grupoqueloide, e 5 pacientes hígidos sem queloides que conformará o grupo controle. Logo, será extraído omaterial genético das amostras e será feito um pool gênico de cada grupo com o qual sera analisados 84 genes marcadores do estresse oxidativo utilizando o kit PAHS-065Z, RT Profiles PCR Array Human Oxidative Stress. Os experimentos serão realizados em triplicata. (AU)

Resumo

A criopreservação de sêmen equino tem crescido nos últimos anos devido à facilidade de transporte e armazenamento do material genético de garanhões por longo período de tempo. No entanto, apesar do crescimento, ainda observa-se grande influência do processamento na qualidade espermática dos garanhões. Dentre outros fatores, sabe-se que o processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e que a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas Espécies Reativas de Oxigênio (ROS). Dentre os diversos antioxidantes existentes, o Butil-Hidroxitolueno (BHT), análogo sintético da vitamina E, pode melhorar a viabilidade espermática uma vez incluído nos meios de refrigeração e congelação. Este experimento tem como objetivo avaliar o efeito do BHT no diluidor sobre a sobrevivência, motilidade espermática, integridade da membrana plasmática e atividade mitocondrial dos espermatozoides equinos antes e após o processo de criopreservação - refrigeração e congelação, além de avaliar o efeito do BHT quanto à sua capacidade de proteger os espermatozoides do efeito tóxico das ROS. A inclusão desse antioxidante nos meios de refrigeração e congelação talvez possa melhorar a viabilidade espermática não só de garanhões considerados bons à refrigeração good coolers e congelação good freezers, mas principalmente aqueles animais classificados como ruins sob a refrigeração e congelação bad coolers e bad freezers respectivamente. (AU)

Resumo

O surgimento das biotecnologias aplicadas ao sêmen equino como o processo de refrigeração e congelação representaram um grande avanço para equinocultura, principalmente por permitir um melhor aproveitamento do ejaculado, otimizando a utilização de animais considerados geneticamente superiores. Entretanto na aplicação dessas técnicas ocorre a remoção do plasma seminal e junto com ele inúmeras substâncias antioxidantes são eliminadas, permitindo que as células espermáticas estejam mais susceptíveis aos traumas causados pela ação das espécies reativas do metabolismo do oxigênio (ROS). Desta maneira surge a necessidade de se introduzir elementos que desempenhem esta função antioxidante nos meios de refrigeração e congelação. A quercertina é considerada um poderoso antioxidante por reduzir o surgimento das principais ROS, apesar disto sua aplicação sobre o ejaculado equino durante o processo de criopreservação ainda é pouco referenciada, sendo necessário mais estudos para que se determine se há de fato influência positiva de sua utilização no ejaculado equino para o sêmen resfriado e congelado. (AU)

Resumo

RESUMOA cultura de cana-de-açúcar, no Brasil, permanece no campo durante todo o ano sendo, portanto submetida à grande variação do ambiente nas diversas estações climáticas. No período do inverno em algumas regiões produtoras de cana-de-açúcar, é comum a ocorrência simultânea de baixa temperatura e deficiência hídrica, afetando vários processos fisiológicos da planta. Para sobreviver às condições adversas, as plantas aclimatam-se e exibem respostas que conferem tolerância diferencial nos diversos tipos de cultivares de cana-de-açúcar. A variação da temperatura afeta diretamente a cinética e termodinâmica das reações bioquímicas e consequentemente, as respostas fisiológicas da planta. Já a deficiência hídrica tem impacto variável na produtividade agrícola dependendo da cultivar, da intensidade e da fase fenológica em que ocorre. Os efeitos da deficiência hídrica são prejudiciais quando há ocorrência tanto na fase inicial de estabelecimento das plantas, como também na fase de intenso crescimento. A deficiência hídrica e a baixa temperatura causam estresse oxidativo, mas as modificações e consequências induzidas pelos oxidantes nas respostas das diversas cultivares de cana-de-açúcar não são bem esclarecidas. Os estresses abióticos também afetam a comunicação raiz-parte aérea da planta, afetando as respostas estomáticas e, consequentemente a fotossíntese. O objetivo deste trabalho é testar a hipótese que cultivares de cana-de-açúcar mais tolerantes à deficiência hídrica e/ou baixa temperatura apresentam metabolismo do carbono (fotossíntese e metabolismo de carboidratos) menos suscetível a estes fatores ambientais, devido provavelmente à eficiente comunicação entre raízes e parte aérea e proteção aos danos oxidativos. Para atingir este objetivo, estudaremos os efeitos da ocorrência de baixa temperatura e/ou deficiência hídrica sobre a fotossíntese (trocas gasosas e atividade fotoquímica); sobre o metabolismo de carboidratos (acúmulo de carboidratos e atividade de enzimas), sobre o metabolismo oxidativo e a comunicação raiz-parte aérea em dois genótipos de cana-de-açúcar, com diferentes características. (AU)

Resumo

A pele está constantemente exposta a estresse oxidativo induzido por espécies reativas de oxigênio (EROs), tais como H202, ânion superóxido e oxigênio singlete, os quais estão indiretamente relacionados ao câncer, ao envelhecimento e à várias doenças inflamatórias. Vários estudos demonstram claramente os efeitos protetores dos antioxidantes quando aplicados em cultura de células ou em animais. No entanto, é importante considerar a capacidade antioxidante de todo o estrato córneo e as possíveis interações com outras biomoléculas e com os antioxidantes basais. Nesse sentido, técnicas não-invasivas têm recebido maior atenção nos últimos anos. Estas têm sido utilizadas por nosso grupo de pesquisa para avaliar a eficácia e segurança de formulações cosméticas e ingredientes ativos. Todavia, apesar de todos os trabalhos publicados, questões fundamentais relativas ao papel dos antioxidantes no processo inflamatório permanecem sem resposta. Assim, os objetivos do presente estudo são identificar indicadores cutâneos do processo inflamatório, desenvolver método de avaliação da atividade antioxidante in vivo e, avaliar a atividade antioxidante in vivo de Zn(II)-glycine e outras substâncias antioxidantes, assim como seus efeitos no processo inflamatório da pele. Para isso serão realizadas avaliações clínicas de biofísica e análise de imagem da pele de voluntárias cujo processo inflamatório foi induzido em áreas demarcadas do antebraço e ensaio de atividade da catalase por meio de tape stripping. (AU)

Resumo

O consumo crônico de etanol atua como um importante fator de risco no desenvolvimento de doenças cardiovasculares, induzindo aumento da pressão arterial, alteração na reatividade vascular, inflamação e aumento do estresse oxidativo em vários tecidos. Além disso, estudos mostram que o consumo crônico de etanol induz aumento dos níveis de TNF-alfa(Fator de necrose tumoral - alfa), uma citocina pró-inflamatória associada à disfunção vascular. O receptor TNFR1 induz ativação das vias intracelulares das MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases) e NFkB (fator nuclear kappa B), além de causar redução da biodisponibilidade de NO (óxido nítrico) e aumento da produção de ERO (espécies reativas de oxigênio) e citocinas pró-inflamatórias. Além disso, a inflamação vascular causada pelo consumo de etanol pode envolver a participação do tecido adiposo perivascular (Perivascular adipose tissue - PVAT), conhecido como uma importante fonte de adipocinas e citocinas pró-inflamatórias, incluindo o TNF-alfa. Em condições fisiológicas, o PVAT desempenha ação benéfica na regulação do tônus vascular, no entanto pode ser prejudicial em situações patológicas. Diante desses dados, a hipótese do presente estudo é a de que o consumo crônico de etanol estimule a produção de TNF-alfa que, por sua vez, induzirá um aumento na produção de ERO, redução de NO, ativação das MAPKs e NFkB, produção de interleucinas (IL-1B, IL-6 e IL-18). Haverá prejuízo no papel protetor do PVAT sobre o tônus vascular. Tais processos levarão a disfunção vascular com conseqüente alteração da reatividade vascular e aumento da pressão arterial. Logo, o presente trabalho é delineado de forma a avaliar a participação do TNF-alfa nos efeitos vasculares induzidos pelo consumo crônico de etanol e o envolvimento do PVAT neste processo. (AU)

Resumo

Nos últimos 5 anos estivemos envolvidos na investigação de dislipidemias genéticas como fatores desencadeantes de alterações da homeostase energética (corporal e celular) que repercutem na suscetibilidade à obesidade, síndrome metabólica e aterosclerose. Tais achados são totalmente originais, uma vez que as dislipidemias são geralmente consideradas conseqüências (e não causas) de distúrbios metabólicos. Além disso, tais resultados evidenciam mecanismos específicos que podem ser potenciais alvos de intervenção. Para tais estudos, utilizamos camundongos geneticamente modificados que apresentam os fenótipos de dislipidemias muito freqüentes na população humana. Temos sido bem sucedidos em publicar nossos resultados em revistas científicas com política editorial rígida. No entanto, o desenvolvimento dos projetos de alunos de pós-graduação e com colaboradores tem sido limitado pela inconstância das condições de criação e manutenção destas colônias de transgênicos e falta de pessoal treinado. Além disso, uma série de procedimentos experimentais laboriosos e de relativa complexidade é necessária para atingir a maior parte dos objetivos da presente proposta. Assim, profissionais de nível superior, com formação em Biologia (ou áreas afins) poderão aprender a gerenciar nosso biotério, bem como executar tarefas de média e alta complexidade, as quais trarão bom impacto na qualidade e quantidade de nossa produção científica, bem como na formação do próprio profissional. Plano de Trabalho - Manipulação e expansão das colônias dos nocautes de receptor de LDL (cruzamentos, sexagem, identificação, registro genealógico, genotipagem, pesagem, coleta de sangue, etc), de acordo com procedimentos estabelecidos em biotérios internacionais e normas da Comissão de Ética no Uso de Animais Experimentação.- Participar da execução e controle dos diferentes regimes dietéticos (restrição calórica e dieta rica em gordura).- Preparar mitocôndrias com alto controle respiratório de tecidos dos camundongos dislipidêmicos (extração do órgão, centrifugação diferencial, medida de consumo de oxigênio), conforme descrito na Metodologia do projeto temático.- Determinar lesão aterosclerótica dos camundongos dislipidêmicos por análise histológica-morfométrica da raiz da aorta, conforme descrito na Metodologia do projeto temático. (AU)

Resumo

O esmagamento de raízes motoras, ou axoniotmese, é um importante problema médico e pode ocorrer devido a herniação de disco intervertebral, estenose espinal e tumores. O esmagamento, apesar de gerar sinais clínicos graves é menos severo que a avulsão, uma vez é mantida a continuidade entre o SNC e SNP, facilitando a regeneração subsequente. Modificações metabólicas nos astrócitos e micróglia, nos estágios iniciais pós-lesão, a denominada reatividade glial, apresenta papel dual no microambiente da lesão. Após um tempo maior decorrido da lesão, os astrócitos desempenham uma função inibitória à regeneração, promovendo a formação da cicatriz glial. A maior parte da morte neuronal ocorre por mecanismos apoptóticos e estresse oxidativo. Portanto, muitas drogas antioxidantes estão sendo estudadas com o intuito de minimizar esses eventos. Dentre elas destaca-se o Tempol, que já mostrou-se capaz de atenuar os efeitos das espécies reativas de oxigênio. Nesse sentido, o presente estudo pretende avaliar o efeito do Tempol na sobrevivência dos motoneurônios medulares e também na reatividade de astrócitos e microglia, em ratos adultos Sprague-Dawley após sofrerem esmagamento das raízes ventrais L4, L5 e L6. Os ratos serão divididos em dois grupos: (1) esmagamento das raízes ventrais e administração intraperitoneal de solução salina e (2) esmagamento de raízes ventrais e administração intraperitoneal de Tempol. Após sobrevida de 14 dias os animais serão sacrificados. A sobrevivência neuronal será estudada por coloração de Nissl e a técnica de imunohistoquímica será empregada para avaliar a expressão de GFAP e Iba1, que são, respectivamente, marcadores de astrócitos e microglia. (AU)

Resumo

Óxidos de colesterol são derivados oxigenados do colesterol que regulam o desenvolvimento da aterosclerose, por modularem seletivamente o estresse oxidativo e inflamatório e mediarem a exportação de lípides em macrófagos arteriais. Além disso, atuam como precursores de ácidos biliares na etapa final de excreção do colesterol na bile. O 27-hidroxicolesterol é o óxido de colesterol mais abundante na circulação, carreado principalmente pelas HDL. O exercício físico regular melhora o transporte reverso de colesterol, promovendo a remoção de colesterol de macrófagos e seu trânsito ao fígado, o que contribui para a redução da aterosclerose. Nossa hipótese é de que o treinamento físico possa alterar a concentração e a distribuição de subespécies de óxidos de colesterol no compartimento plasmático e arterial em camundongos dislipidêmicos, refletindo a mobilização de lípides arteriais pelo transporte reverso. O objetivo deste estudo é avaliar a concentração e distribuição de óxidos de colesterol no plasma e aorta de camundongos knockout para E submetidos a programa de treinamento físico aeróbio. Os animais serão aleatoriamente divididos em grupo sedentário e treinado (esteira 15m/min, 30 min por dia, 5 vezes na semana, durante 6 semanas). A concentração de colesterol total, HDL colesterol, triglicérides e glicose será determinada por métodos enzimáticos e a dos óxidos de colesterol (24S-hidroxicolesterol, 25-hidroxicolesterol, 27- hidroxicolesterol, 7-cetocolesterol, 7 beta-hidroxicolesterol), por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massa (CG-MS), após extração do plasma e tecido arterial. O mRNA total será extraído da aorta para quantificação da expressão das Cyp27a e Cyp7b (as quais, respectivamente, geram e convertem o 27-hidroxicolesterol). Os achados serão importantes para compreensão dos mecanismos pelos quais o exercício físico previne e regride a aterosclerose e indicará se a concentração de óxidos de colesterol pode ser um marcador desses efeitos. (AU)

Resumo

A poluição atmosférica é um fator de risco ambiental, principalmente nos grandes centros urbanos e está, atualmente, associada com a mortalidade por câncer de pulmão. Neste contexto, destaca-se a região metropolitana de São Paulo, que concentra importantes complexos industriais e, com sete milhões de veículos, possui uma das maiores frotas de veículos do planeta. Pesquisas mostram que a exposição aos poluentes atmosféricos é capaz de causar diversos efeitos à saúde, tais como: aumento da resposta pró-inflamatória, estresse oxidativo entre outros. Tais efeitos por sua vez induzem outras diversas respostas celulares, como por exemplo, a formação de danos no DNA pode desencadear um evento mutagênico se não for eficientemente removida por vias de reparo de DNA. Recentemente, estudos mostram que a via de reparo por excisão de nucleotídeos está envolvida no reparo de lesões causadas por agentes ambientais. Até o momento, poucos trabalhos com resultados que mostram o mecanismo de ação de poluentes atmosféricos urbano e esta via de reparo foram desenvolvidos. Portanto, o presente trabalho propõe o estudo da ação do material particulado (MP), proveniente da região metropolitana de São Paulo, na indução e reparo de danos ao DNA e, se estes danos podem levar a formação de neoplasias, principalmente no pulmão. Para esse estudo serão empregados camundongos deficiente para essa via de reparo, KO para o gene XPA. Os resultados desta pesquisa deverão subsidiar o conhecimento dos mecanismos de ação dos poluentes associados com o câncer de pulmão. Este estudo também proverá a quantificação de nanopartículas e a caracterização química dos poluentes atmosféricos da região metropolitana de São Paulo. (AU)

Resumo

Prospecção, seleção e caracterização enzimática de superóxido dismutase e catalase em bibliotecas metagenômicas, originadas de diferentes solos: O intenso progresso industrial observado atualmente gera grandes quantidades de resíduos poluentes que são danosos ao meio ambiente. Esses resíduos causam impactos irreparáveis aos locais em que são introduzidos sendo comum o uso de organismos como biomarcadores desses locais poluídos. A relação da atividade enzimática com os efeitos provocados pelo agente estressor nos sistemas vivos provoca a produção de espécies reativas de oxigênio (EROS), tais como o íon superóxido (O2-), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (OH-) e oxigênio livre (O1). Esses compostos podem ocasionar a morte celular se não forem neutralizados e, para tanto, os organismos aeróbios desenvolveram um mecanismo de defesa contra o estresse oxidativo como a síntese das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa redutase (GR) e glutationa-S-transferase (GST). Essas biomoléculas são empregadas nos processos industriais e, em relação aos produtos químicos, apresentam como vantagem altíssima especificidade ao substrato, reduzindo significativamente a obtenção de produtos indesejáveis na reação e etapas de purificação, além de apresentar a possibilidade de imobilização e recuperação dessas enzimas para novos usos no processo, não necessitando de temperaturas e pressões elevadas nas diferentes operações. Em geral, esses biocatalizadores são obtidas em diferentes escalas (laboratorial, piloto ou industrial) fazendo o uso de tecnologias do DNA recombinante a partir da expressão homóloga ou heteróloga desses genes de interesse biotecnológico. As oxido-redutases como as SOD e CAT são utilizadas da mesma forma que as enzimas hidrolíticas, entretanto, apresentam enorme potencial de uso e tendência no aumento quanto à participação no mercado, como na área médica, analítica e científica, diagnóstico clínico, indústria alimentícia, na formulação de cosméticos e em processos de biorremediação de efluentes que contenham compostos fenólicos e aminas aromáticas. Neste contexto, a ferramenta denominada metagenômica tem sido amplamente utilizada na obtenção de enzimas de interesse biotecnológico, principalmente pelo fato desta abordagem permitir o acesso a genes de microrganismos incultiváveis, visto que as análises envolvendo o estudo da diversidade microbiana comprovaram que conhecemos aproximadamente 1% existentes na biosfera. (AU)

Resumo

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, é capaz de utilizar carboidratos e aminoácidos como fontes de carbono e energia. Vários aminoácidos mostraram também estar envolvidos em outros processos fundamentais para a progressão do ciclo de vida do parasito. O aminoácido histidina participa em diversos organismos de uma grande quantidade de funções biológicas (como antioxidante, fornecedor de intermediários metabólicos através da conversão a glutamato, regulador da disponibilidade de metais como Cu2+ ou Ni2+ através da sua coordenação, entre outros). Porém, seu estudo foi pouco abordado em tripanosomatídeos. O presente projeto, parte de uma colaboração já em andamento entre os laboratórios do Dr. Silber e da Dra. Nowicki (Universidade de Buenos Aires - Argentina). Através desta proposta se combinarão experiências e conhecimentos para explorar os possíveis mecanismos mediante os quais a histidina pode agir como protetor perante o estresse oxidativo. Nesse intuito, os parasitas serão desafiados com estressores oxidativos na presença e ausência de histidina, e serão analisadas em forma comparativa as atividades enzimáticas chave para manter o equilíbrio redox, particularmente as relacionadas com a produção de NADPH e com o metabolismo dos aminoácidos enxofrados. Também irão se avaliar os níveis de expressão daquelas enzimas cujas atividades sejam afetadas nas distintas condições experimentais a serem ensaiadas. Finalmente serão investigadas em extratos de parasitas submetidos a estresse ou não, as possíveis variações nos níveis de tióis de baixa massa molecular e biologicamente relevantes. (AU)

Resumo

A nefropatia induzida por contraste (NIC) está diretamente associada a doenças crônicas que comprometem a oxigenação da região da medula renal. Os estados de hiperglicemia crônica determinam alterações hemodinâmicas na microvasculatura, disfunção endotelial e ativação de processos inflamatórios e lesão oxidativa, incorrendo em redução da taxa de filtração glomerular (TFG). Este estudo visa investigar a NIC na situação de risco como o Diabetes Mellitus (DM) e a doença renal pré existente e demonstrar a ação de mediadores de mecanismos de lesão endotelial e da microvasculatura renal. Material e Métodos: serão utilizados ratos Wistar, adultos, machos e células tubulares proximais HK-2 e IRPTC. O DM será induzido por meio da administração de estreptozotocina (STZ, diluída com citrato) e será realizada a ablação de massa renal 5/6, como modelo de doença renal crônica (Nx). As células serão submetidas a meio hiperglicêmico. Serão realizados ensaios de interferência na integridade da vasculatura renal e redução do estresse oxidativo nos grupos DM e Nx (PGE1, HO-1, iNOS). Serão avaliadas a função renal por meio do clearance de inulina e microalbuminúria, o estresse oxidativo, a expressão e quantificação de óxido nítrico sintase induzível (iNOS), HO-1 e HO-2, histologia do tecido renal e, para as células, análise expressão gênica da HO-1, HO-2 e NO sintase, dosagem de NO, transfecção de células HK-2 e IRPTC com siRNA para HO-1 e transfecção de células HK-2 e IRPTC com plasmídio para HO-1. (AU)

Resumo

As doenças neurodegenerativas são caracterizadas pela perda progressiva dos neurônios no sistema nervoso central e, de modo geral, apresentam causas desconhecidas. Fatores como idade, genéticos e ambientais, o aumento da formação de radicais livres, disfunção mitocondrial, neuroinflamação, acúmulo de elementos neurotóxicos, alterações na homeostasia do Ca2+ e no metabolismo energético podem contribuir para o desenvolvimento do processo neurodegenerativo. Nos últimos anos, vários estudos empregando diferentes modelos experimentais de neurotoxicidade e neuroinflamação têm sugerido propriedades neuroprotetoras do sistema canabinóide, com a participação de endo e/ou exocanabinóides e dos receptores canabinóides CB1 e CB2 nesses processos. No entanto, os mecanismos subjacentes à neuroproteção não são claros e os dados da literatura são ainda conflitantes. O objetivo deste projeto é avaliar a participação do sistema canabinóide em modelos in vivo e in vitro de neurodegeneração, investigando aspectos relacionados ao estresse oxidativo, neuroinflamação, homeostase do cálcio e do retículo endoplasmático e os efeitos do tratamento com compostos canabinóides. Utilizaremos um modelo de neurodegeneração in vivo que reproduz alguns aspectos da Doença de Alzheimer em ratos (injeção intracerebroventricular de estreptozotocina) e modelos in vitro de cultivos de uma linhagem de neuroblastoma e cultivos primários de neurônios e células da glia. Serão avaliados parâmetros como distribuição dos receptores, viabilidade celular/proliferação e produção de espécies reativas, bem como abordagens que permitam elucidar possíveis mecanismos de ação dos canabinóides pela análise de níveis de proteína e de expressão gênica. (AU)

Resumo

A saliva é um fluido produzido e secretado pelas glândulas salivares cujo papel na homeostase do indivíduo é bastante conhecido. Diversas doenças têm como consequência a redução do fluxo salivar ou a xerostomia, dentre elas o diabete melito e a insuficiência renal crônica, tendo-se em ambas um aumento de estresse oxidativo sistêmico. O diabete é uma doença caracterizada por uma hiperglicemia crônica. Em estudos anteriores demonstramos alterações no sistema antioxidante, aumento do estresse oxidativo e alteração no potencial energético nas glândulas salivares no estado diabético. A insuficiência renal crônica (IRC) é outra doença que acomete grande parte da população mundial com graves repercussões bucais. Diversos estudos mostraram alterações salivares em pacientes com insuficiência renal crônica, contudo raros são os que utilizam a glândula como fonte de informações. O uso de terapias com antioxidantes, como vitaminas C e E tem demostrado melhoria no quadro de estresse oxidativo nestes grupos de doenças. Diante do exposto, os objetivos do presente estudo são:1) verificar a presença de dano oxidativo em ratos com ablação de 5/6 da massa renal,12 semanas após a cirurgia, assim como alterações no potencial energético das glândulas submandibular (SM) e parótida (PA); 2) Verificar os possíveis benefícios da utilização de suplementação de Vitaminas C e E na prevenção dos danos oxidativos já verificados em animais diabéticos e nos animais com IRC. (AU)

Resumo

Sub-projeto-01: O estresse oxidativo tem sido associado à etiopatogenia de doenças humanas, como a doença de Alzheimer (DA) e o Diabetes Mellitus (DM), mas as bases moleculares destas ainda são pouco elucidadas. Considerando a hipótese de que o estresse oxidativo e alterações nos mecanismos de reparo do DNA constituem fatores importantes para o desenvolvimento da DA e do DM tipo 1 (DM1), o projeto tem como objetivos: 1) Análise bioinformática dos perfis de expressão gênica transcricional (dados obtidos por microarranjos), visando detectar genes com expressão significativamente alterada em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes com DA em relação a idosos sadios (estes serão comparados aos dados já obtidos para o grupo DM1: doutorado de Paula Takahashi); 2) Analisar a expressão de alguns genes e proteínas (com base nos resultados obtidos por microarranjos, comparações: DA versus controles e DM1 versus controles) por meio de PCR quantitativa em tempo real e Western blot, respectivamente; 3) Analisar a expressão de microRNAs (microarranjos) em pacientes com DA em relação a idosos sadios (estes serão comparados aos dados já obtidos para o grupo DM1: doutorado de Paula Takahashi), visando buscar a associação dos microRNAs com RNAs mensageiros, principalmente de genes de resposta ao estresse oxidativo/reparo; 4) Validar interações microRNA-RNA mensageiro pelo ensaio do gene repórter luciferase; 5) Estudar a expressão de algumas proteínas-chave da via da TP53, visto que em estudo anterior esta proteína se mostrou mais expressa em DA (Leandro et al., Int J Mol Sci. 14(6): 12380, 2013). Os dados a serem gerados poderão contribuir com informações relevantes para a compreensão do papel do estresse oxidativo e do reparo do DNA na etiopatogenia da DA e DM1, com a possibilidade de detectar vias comuns com regulação gênica modificada nessas doenças.Sub-projeto-02: O glioblastoma multiforme (GBM) é um dos tumores mais letais e a resistência destes aos tratamentos convencionais constitui um grande desafio a ser superado. A presente proposta tem como enfoque a aplicação de inibição molecular (genes de reparo do DNA e fatores de transcrição) visando influenciar as respostas das células de GBM à droga TMZ ou às radiações, no sentido de incrementar a letalidade celular. Os objetivos consistem em avaliar os efeitos da inibição da enzima de reparo PARP-1 pelo agente NU1025 (inibidor de PARP-1) em linhagens de GBM resistentes (LN18 e T98G) à droga TMZ, com diferenças no status do gene PTEN (normal e mutado, respectivamente). A influência de PTEN (o qual também participa na via HR) nas respostas celulares será estudada pela inibição deste por siRNA na linhagem LN18, sendo que a participação do reparo MGMT será também avaliada pela inibição deste (inibidor O6-BG) nas mesmas linhagens (proficientes para esse reparo). Os efeitos dos tratamentos combinados (TMZ + NU1025) serão avaliados por vários ensaios ao nível celular (sobrevivência clonogênica, cinética do ciclo celular, indução de danos no DNA por ³-H2AX e apoptose) e molecular (perfis de expressão gênica, proteica e ensaios funcionais de inibição por siRNA). Além disso, com base em fundamentos da literatura e em dados anteriormente obtidos, a inibição de fatores de transcrição será também testada como possível estratégia para aumentar a letalidade das células de GBM, sendo utilizado o inibidor químico HLM006474, o qual tem como alvo as proteínas da família E2F. Esse inibidor será testado em células de GBM (U87MG e U343MG-a) expostas à irradiação com raios-gama, sendo as respostas celulares avaliadas por meio da vários ensaios funcionais ao nível celular e molecular (incluindo o método de microarranjos). Adicionalmente, o background genético dessas células será também considerado na interpretação dos dados, sendo que alguns genes de interesse serão sequenciados. (AU)

Resumo

A abelha Apis mellifera é responsável pela polinização de diversos tipos de cultivares agrícolas no Brasil. No entanto, o uso indiscriminado de pesticidas nas monoculturas, associado à fragmentação do habitat e patógenos, está causando o declínio das populações de abelhas ao redor do mundo. O presente projeto tem como objetivo a análise dos efeitos biológicos da interação do inseticida tiametoxam e do fungicida picoxistrobina em larvas e adultos de operárias de A. mellifera africanizada por meio de bioensaios toxicológicos de exposição crônica às concentrações realísticas desses pesticidas, bem como avaliar os biomarcadores celulares de estresse oxidativo no corpo gorduroso das larvas e adultos de A. mellifera submetidas aos bioensaios. O órgão selecionado para as análises imuno-histoquímicas com a finalidade de detectar os biomarcadores celulares é o corpo gorduroso das larvas e adultos de A. mellifera, uma vez que esse órgão também tem função no metabolismo de xenobióticos. As informações geradas pelo projeto, em termos práticos, poderão subsidiar futuros programas de monitoramento de contaminação das abelhas no campo utilizando os biomarcadores celulares em indivíduos coletados em apiários localizados no entorno das áreas agrícolas. (AU)

Resumo

Diabetes Mellitus (DM) é uma desordem crônica causada pela falta da síntese de insulina pelas células beta (²)-pancreáticas ou pelo defeito nos receptores de insulina nas células-alvo. Diversos modelos in vivo apresentam evidências que o pâncreas adulto tem capacidade de regeneração, sendo isto particularmente observado em condições experimentais. Atualmente, há evidência que a associação diabete e gravidez leva ao aumento do estresse oxidativo e modificações nos níveis de hormônios sexuais femininos. Com o propósito de controlar essas alterações, a prática de exercício físico associado à dieta passou a ser o primeiro passo na terapia anti-hiperglicemiante do binômio DM e gravidez. Entretanto, há falta de evidências científicas relacionando o efeito da prática de exercício físico durante a gestação com relação a marcadores de estresse oxidativo e hormônios sexuais femininos, o que se faz necessário para tornar a indicação dessa prática mais segura para gestantes. Sendo assim, o objetivo do presente estudo é avaliar os marcadores de estresse oxidativo, hormônios sexuais e de proliferação pancreática em ratas com diabete submetidas ao exercício físico (natação) de intensidade moderada durante a prenhez. Para isso, serão utilizadas ratas da linhagem Wistar. O diabete moderado será induzido nos Recém-Nascidos (RN) fêmeas no primeiro dia de vida (100 mg de streptozotocin/kg de peso corporal). Para compor o grupo não-diabético (controle), os RN receberão o veículo (tampão citrato) em volume e período similares ao grupo diabético. Na fase adulta, as ratas dos dois grupos serão anestesiadas para coleta de amostras de sangue para determinação glicêmica, marcadores de estresse oxidativo e de hormônios sexuais. Em seguida, todos os animais serão submetidos à fase de acasalamento com machos não diabéticos e, confirmada a prenhez, serão distribuídos em quatro grupos: controle sedentário, controle exercitado, diabético sedentário e diabético exercitado. Os animais dos grupos exercitados serão submetidos à prática de natação de intensidade moderada durante a prenhez. No 18.5º dia de prenhez, as ratas serão anestesiadas com tiopental sódico (50mg/Kg) e sacrificadas para análise da performance reprodutiva, marcadores de estresse oxidativo, determinação de hormônios sexuais e análise imunoistoquímica do pâncreas materno. (AU)

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Uma vez que embriões bovinos produzidos in vitro são mais suscetíveis aos danos oxidativos, a suplementação com antioxidantes nos meios de maturação in vitro (MIV) tem demonstrado resultados satisfatórios sobre o desenvolvimento embrionário. Além do uso de antioxidantes, a adição de inibidores da lipogênese e/ou estimuladores da lipólise também refletem de maneira positiva sobre o desenvolvimento, qualidade e criotolerância embrionária. Visando melhorar a qualidade, o potencial de desenvolvimento e o sucesso da criopreservação de embriões bovinos, o principal objetivo deste estudo é promover modificações em algumas etapas do sistema de produção in vitro para minimizar os danos causados pelo estresse oxidativo e pelo acúmulo de lipídios no citoplasma. Desta forma, os oócitos serão maturados em meio TCM-199 suplementado com 0,6 mM de cisteína associado à 100 ¼M de cisteamina e à 100 UI de catalase (C+C+CAT) ou sem suplementação com antioxidantes (Controle). Posteriormente os oócitos serão submetidos à fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV), sendo que nesta última etapa serão adicionadas drogas estimuladoras da lipólise / inibidoras da lipogênese ao meio de cultivo. Assim, os zigotos serão cultivados em meio SOF suplementado com 100 ¼M de ácido linoleico conjugado (CLA), ou 2,5 ¼M de Forskolin (FORSK), ou ainda CLA associado ao Forskolin (CLA+FORSK). A clivagem embrionária será avaliada 48 horas pós-inseminação (hpi) e o desenvolvimento embrionário será avaliado 144 e 168 hpi. Os embriões serão avaliados quanto ao conteúdo total de lipídeos, a partir da coloração com Nile Red, e também terão os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ROS: H2O2, HO*, ROO*) quantificados, através da coloração com a sonda fluorescente diacetato de 6-carboxi-2',7'-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA). Os embriões que passarem pelo processo de vitrificação serão aquecidos e cultivados em meio SOF por 24 horas, nas mesmas condições que foram estabelecidas durante o CIV (atmosfera gasosa e antioxidante) e, então, as taxas de re-expansão embrionária (sobrevivência in vitro) e eclosão serão avaliadas às 24 horas de CIV após o reaquecimento (AU)

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Introdução: Estudos prévios (processo FAPESP n. 2011/13709-2, Cintra et al., 2013, 2014ab) denotaram danos causados às células pulpares, bem como o processo de reparo dessas, após sofrerem um estresse oxidativo devido à presença de agente clareador sobre a superfície dentária. Objetivo: aprofundar o estudo dos mecanismos envolvidos na resposta celular para o entendimento das alterações pulpares decorrente da aplicação de dois protocolos de clareação dentária à base de Peróxido de Hidrogênio (PH). Métodos: Serão utilizados 40 ratos da linhagem Wistar divididos em 2 grupos experimentais de 20 hemi-maxilas cada: BLUE (PH20%, 1x45min) e MAXX (PH 35%, 3x15mim). Serão clareados molares superiores de cada animal com um dos protocolos e outros molares sem tratamento serão utilizados para controle. Após 2 e 30 dias, os animais serão sacrificados e as maxilas removidas e processadas laboratorialmente para avaliação histológica (H.E.) e imunohistoquímica (Caspase-3-ativada, PCNA e CD5). Forma de análise: Os cortes teciduais corados em H.E. serão avaliados por critérios pré-estabelecidos atribuindo-se escores aos eventos microscópicos e os resultados serão submetidos à análise estatística, pelos testes de Kruskall Wallis e Dunn (p < 0,05). Os valores de Caspase-3-ativada, PCNA e CD5 obtidos serão submetidos aos testes de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk para definir o teste estatístico a ser empregado (p<0,05). (AU)

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O peixe é importante fonte de proteínas de alto valor biológico, vitaminas e minerais. Porém, este alimento é também uma das principais vias de exposição humana a contaminantes tóxicos como o metilmercúrio (MeHg). Assim a sua acumulação no peixe pode predispor sérios riscos para a saúde humana. Os altos teores de mercúrio encontrados em solo, sedimentos, peixes e humanos na Amazônia brasileira têm sido estudados intensamente pela comunidade científica nas últimas décadas, procurando-se elucidar os mecanismos de toxicidade das espécies mercuriais. As espécies mercuriais ligam-se preferencialmente às metalotioneínas - proteínas de massa molar inferior a 10 kDa, que caracterizam-se por apresentar resíduos de aminoácidos com enxofre, como a cisteína. Isto pode significar que a fração biodisponível das espécies mercuriais nas diferentes espécies de peixes pode ser dependente da forma como estas estão ligadas às proteínas. Portanto esta proposta de trabalho busca otimizar: procedimentos eletroforéticos por 2D-PAGE para fracionamento e identificação de metalotioneínas responsáveis pelo transporte de mercúrio em amostras de tecido muscular e hepático de peixes coletados no reservatório do AHE JIRAU - Bacia do rio Madeira; método para determinação de mercúrio por GFAAS nos spots proteicos obtidos; avaliar estresse oxidativo dos peixes contaminados com mercúrio por meio das atividades das enzimas catalase (CAT), glutationa peroxidase (GSH-Px) e superóxido dismutase (SOD), bem como das concentrações de hidroperóxido de lipídio (HP); caracterização das metalotioneínas transportadoras de mercúrio por ESI-MS e finalmente a análise de expressão dessas proteínas procurando-se possível correlação com a incorporação do mercúrio nos organismos dos peixes. (AU)

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A doença renal crônica (DRC) é um problema de saúde pública. No Brasil, as principais causas de DRC são a hipertensão arterial sistêmica e o diabetes mellitus. Independente da etiologia, a regra é a perda funcional do órgão associada à substituição do parênquima renal por tecido fibroso. A hiperativação do sistema renina angiotensina aldosterona (SRAA) é frequente nas diversas doenças renais e tem papel crucial no desenvolvimento da fibrose e falência renal. Várias linhas de evidências sugerem que a proteína quinase ativada por AMP(AMPK) seja capaz de atuar como um fator de nefroproteção. O objetivo do presente projeto é investigar a interação entre a AMPK e o SRAA no acúmulo de matriz extracelular (MEC), processo que antecede a fibrose renal. Para isso, células mesangiais humanas em cultura serão expostas à angiotensina II (ANG II) associado ou não ao bloqueio do SRAA e estímulos positivos e negativos para a AMPK. A expressão de componentes da MEC serão estimados por Western blot e imunohistoquímica. A regulação da AMPK pela ANG II na fibrose renal tem o potencial de identificar novas alternativas terapêuticas para o tratamento e prevenção da falência renal. (AU)

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O presente projeto visa o desenvolvimento de derivados seleno- e teluro-cumarínicos para estudos de supressão e emissão de fluorescência e aplicações biológicas. Determinadas patologias ou desordens estão associadas a estresse oxidativo (Reactive Oxygen Species, ROS) e tanto o átomo de Se quanto de Te são susceptíveis a oxidação por tais espécies. Devido ao efeito do átomo pesado ambos os elementos, quando conectados diretamente a núcleos fluorofóricos, são capazes de inibir a emissão de fluorescência. Se esses elementos estão oxidados o sistema volta a ser fluorescente. Dessa maneira, planejamos a preparação de derivados cumarínicos contendo os átomos de Se e Te para estudos de marcação celular em que oxidantes endógenos estão superexpressados. Esses estudos serão conduzidos com soluções fisiológicas simuladas em que a produção do oxidante estará superexpressada. Essa proposta está fundamentada na colaboração que firmamos recentemente com um grupo de pesquisadores da Universidade Nova de Lisboa que possui uma vasta experiência na aérea de sensores fluorescentes. Nesse particular devemos comentar que para a viabilização dos estudos experimentais envolvendo as duas equipes, aprovamos recentemente um projeto bilateral financiado pelo CNPq através do Programa Ciências sem Fronteiras em que foram concedidas 3 bolsas de pós-doutoramento para membros da equipe portuguesa para virem realizar parte dos experimentos em nosso grupo e 3 bolsas de doutorado sanduiche para alunos de nosso grupo. (AU)

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No processo de envelhecimento ocorre uma diminuição funcional orgânica. No Brasil, o câncer mais frequente é o de pele, correspondendo a cerca de 25% de todos os tumores diagnosticados em todas as regiões geográficas. A radiação ultravioleta (RUV), proveniente do sol, é o seu maior agente etiológico. Alterações celulares e estruturais surgem como consequência de uma associação entre RUV e envelhecimento cronológico. As pesquisas experimentais sobre envelhecimento devem ser desenvolvidas a partir de parâmetros que separem as características do fotoenvelhecimento do envelhecimento cronológico e busquem modelos animais com estrutura tegumentar análoga a de humanos. Diferentes estratégias são utilizadas para a prevenção e tratamento do fotoenvelhecimento. A análise fitoquímica de muitas plantas utilizadas com esta finalidade tem demonstrado que estas contêm substâncias que apresentam efeitos antioxidantes importantes na prevenção e no tratamento do fotoenvelhecimento. A laserterapia de baixa intensidade (LTBI) é amplamente indicada no tratamento do fotoenvelhecimento e tem sido utilizada em diferentes intensidades para estimular ou inibir processos celulares e facilitar a absorção de substâncias utilizadas como protetoras de danos celulares. A fotobiomodulação celular pela LTBI ainda não é completamente esclarecida em seus efeitos moleculares e há necessidade de mais estudos que venham esclarecer estes mecanismos e entender os efeitos benéficos intrínsecos desta terapia, inclusive no processo de fotoenvelhecimento. Desta forma, a proposta deste estudo é investigar e contribuir na elucidação da ação isolada e associada do laser com comprimento de onda na faixa do vermelho e do extrato do fruto de Lycium barbarum na prevenção e no tratamento do fotoenvelhecimento. (AU)

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Estudos clínicos têm sistematicamente relacionando a síndrome metabólica / obesidade a sintomas do trato urinário inferior, também referidos como LUTS (da sigla Lower Urinary Tract Symptoms), os quais compreendem diversas queixas relacionadas a problemas de armazenamento e/ou esvaziamento da bexiga urinária. Estes sintomas acometem milhares de pessoas em todo o mundo, estando relacionados à frequência, urgência e noctúria, e frequentemente associados à bexiga hiperativa, que pode evoluir para incontinência urinária. A despeito dos estudos epidemiológicos apontarem para uma correlação positiva entre síndrome metabólica/obesidade e LUTS, os mecanismos fisiopatológicos envolvidos permanecem pouco compreendidos. É sabido que a uretra possui um papel importante na fisiologia do ciclo miccional, pois participa ativamente do ciclo miccional, contribuindo para as fases de armazenamento e de eliminação da urina. Entretanto, a uretra é uma estrutura totalmente negligenciada no contexto da fisiopatologia experimental da bexiga hiperativa. Nosso grupo publicou recentemente a existência de disfunção uretral em camundongos obesos por dieta hiperlipídica (Alexandre et al., 2014). Mostramos que o relaxamento uretral em resposta ao NO e a doadores de NO (S-nitrosoglutationa e gliceril trinitrato) está significativamente diminuído no tecido uretral do animal obeso, sendo estes fenômenos associados à degradação da subunidade ²1 da guanilil ciclase solúvel (GCs) e menor produção de GMPc, assim como a aumento local da geração de ROS. Sabe-se que o tecido adiposo de animais obesos expressa TNF-±, citocina pró-inflamatória capaz de promover resistência à insulina e de ativar o complexo NADPH oxidase. No presente projeto, levantamos a hipótese que a bexiga hiperativa no animal obeso é devida, ao menos em parte, às alterações na fase de eliminação da urina, na qual o relaxamento uretral via ativação da via NO-GCs-GMPc desempenha papel crucial. Dessa forma, é possível que a degradação da GCs seja secundária à excessiva produção de ROS. Encontrar a origem desse estresse oxidativo nos parece relevante para a compreensão da bexiga hiperativa no indivíduo obeso resistente à insulina. Portanto, este presente projeto propõe estudar o papel do estresse oxidativo e degradação da guanilil ciclase solúvel na disfunção miccional do camundongo obeso resistente à insulina, com ênfase para a uretra. Especificamente, investigaremos (1) o efeito da proteção antioxidante resultante da dieta hiperlipídica, através de tratamentos crônicos com apocinina e resveratrol, sobre o relaxamento uretral, produção de ROS, níveis de ânion superóxido e expressão protéica das subunidades a1 e ²1 da GCs; (2) a importância do TNF-a para a disfunção miccional do camundongo obeso, quantificando-se esta citocina na uretra e tecido adiposo periuretral/perivesical, examinando, ainda, a reatividade da musculatura lisa uretral frente à incubação prévia com TNF-a e o efeito do anticorpo anti-TNF-a quanto à capacidade de reverter a disfunção uretral do animal obeso e alterações bioquímico-moleculares no tecido uretral; (3) a atividade da NADPH oxidase e expressão da SOD1 em uretra e tecido adiposo periuretral / perivesical; e (4) a expressão e ativação de proteínas chave envolvidas na sinalização da insulina, bem como o efeito da metformina (agente anti-hiperglicemiante) sobre a disfunção uretral e alterações bioquímico-moleculares do animal obeso. Esse estudo abre portas para o entendimento sobre como a obesidade e o estresse oxidativo interferem na função uretral e qual sua relação com a disfunção vesical. Pesquisas que procurem entender as desordens do trato urogenital e suas relações com a obesidade podem repercutir positivamente não somente para o esclarecimento da fisiopatologia destas mesmas, como também para a melhora da terapêutica e para a prevenção da doença. (AU)

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O óxido de grafeno nanoestruturado apresenta aplicações em áreas como eletrônica, farmacêutica e ambiental. Os seus promissores usos despertam preocupações quanto às consequências para a saúde humana e ambiental do descarte inadequado de seus resíduos e/ou produtos. Apesar dos estudos nanotoxicológicos terem se intensificado nos últimos anos, restam lacunas quanto aos métodos utilizados para avaliação dos riscos da nanotecnologia. Isto se deve à complexidade do comportamento dos nanomateriais no ambiente, em especial na presença de matéria orgânica e na dependência das características do nanomaterial. O objetivo deste estudo é então avaliar os efeitos toxicológicos do óxido de grafeno (OG) através de ensaios in vivo e in vitro com embriões de Danio rerio (peixe-zebra), considerando a influência da presença de debris oxidativos e da interação com substâncias húmicas. Para isso, serão avaliados parâmetros de letalidade e subletalidade, como comprimento total das larvas e biomarcadores bioquímicos de metabolismo (atividade de glutationa S-transferase e fosfatase ácida), estresse oxidativo (atividade de catalase) e neurotoxicidade (atividade de acetilcolinesterase). Espera-se com isso contribuir para o estabelecimento de protocolos de análise além de participar na consolidação da nanoecotoxicologia no Brasil; fornecendo informações que complementem o conhecimento sobre os riscos da nanotecnologia aos organismos vivos e ecossistemas. (AU)

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Tratamentos de superfície são aplicados em implantes dentais com o intuito de aumentar a rugosidade para otimizar a osseointegração. Em que pese o sucesso clínico dos implantes dentais, sabe-se que nanopartículas de titânio podem ser liberadas no tecido periimplantar após a sua inserção no tecido ósseo. Assim, macrófagos são as primeiras células a interagir com estas partículas no sentido de fagocitá-las, desencadeando um estresse oxidativo intracelular e estimulando o processo inflamatório. Esta inflamação pode modular positivamente a reabsorção óssea cervical ao redor dos implantes dentais, também conhecida como saucerização óssea. Neste contexto, é importante avaliar a bioatividade celular que ocorre neste processo inflamatório quando em contato com nanopartículas de titânio. Assim, o objetivo deste trabalho será analisar o comportamento de macrófagos frente a presença de nanopartículas de titânio. A avaliação do estressse oxidativo causado pelas partículas será realizada pelo ensaio de redução do composto diacetato de diclorofluorescina (DCFH-DA). A expressão de citocinas pró-inflamatórias será avaliada por reação imunoenzimática (ELISA). Adicionalmente, será utilizada microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para visualização da incorporação das nanopartículas de titânio pelas células. (AU)

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Introdução: O consumo de carnes em excesso, especialmente carne vermelha e processada, tem sido associado a doenças crônicas, como o câncer. Um dos mecanismos para essa associação é o teor de compostos carcinogênicos, como as aminas heterocíclicas (AH), formados na cocção da carne. No processo de detoxificação destes carcinógenos são geradas espécies reativas, que podem causar estresse oxidativo e dano ao DNA, aumentando risco para câncer. As enzimas envolvidas neste processo têm capacidades de detoxificação diferentes entre as pessoas, devido aos polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) de genes que codificam tais enzimas. Objetivo: Analisar o consumo de carne e AH e sua relação com marcadores bioquímicos (malonaldeído e adutos de DNA), genéticos (polimorfismos de genes que codificam enzimas envolvidas no metabolismo de interesse) e ambientais (tabagismo), além de fatores sociais e demográficos (sexo, idade, renda familiar). Metodologia: O presente estudo foi conduzido em uma amostra representativa de 548 indivíduos, com idade igual ou superior a 20 anos do município de São Paulo. Dados dietéticos, antropométricos e amostras de plasma e DNA foram coletados. Estão sendo finalizadas as análises bioquímicas (malonaldeído, SNP, adutos de DNA). Modelos múltiplos serão testados, considerando o consumo dietético, as concentrações sanguíneas dos marcadores e a interação pela presença das variantes genéticas envolvidas no metabolismo das aminas heterocíclicas. (AU)

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A cárie dental é uma doença infecciosa e multifatorial, biofilme dependente, que tem como principal agente etiológico o Streptococcus mutans. A virulência do S. mutans é baseada na sua capacidade se aderir e formar biofilme na superfície do dente, produzir de ácidos orgânicos e de tolerar o estresse ambiental, particularmente os estresses ácido e oxidativo. Como o S. mutans é capaz de emergir como flora dominante em biofilmes orais mesmo durantes condições adversas ele se torna o ponto central de inúmeros estudos. Sabe-se que o sistema Clp (Protease caseinolítica dependente de ATP) detém o papel central na tolerância desse microrganismo frente ao estresse ambiental e que o controle proteolítico dos reguladores de estresse oxidativo, spxA e spxB, pelo sistema proteolítco ClpXP é central para sua sobrevivência ao estresse. O perfil transcricional das mutantes spxA e spxB (”spxA, ”spxB e ”spxAB) identificou um número de genes sob o controle de SpxA/B que codificam proteínas hipotéticas que podem participar potencialmente nos processos associados com a desintoxicação e proteção contra espécies reativas ao oxigênio (ROS). No projeto de doutorado relacionado (FAPESP #2012/02278-3) foi proposto o estudo de um grupo desses genes, que parecem estar sob o controle de SpxA/B, por meio da criação de cepas isogênicas, seguida pela caracterização fenotípica de cada gene. De fato 10 mutantes isogênicas foram construídas, smu143c, smu144c, smu248, smu569, smu570, smu929, smu1296, smu1497, smu1685 and smu1784c (FAPESP 2012/02278-3). Dessa forma, baseado na caracterização inicial das mutantes simples foi aqui proposto a utilização de um screen para observar o aumento do fenótipo e melhor caracterizar o papel dos genes selecionados frente ao estresse oxidativo. O screen para avaliar o aumento de fenótipo desses genes consiste na construção de mutantes duplas a partir de alguns genes selecionados no projeto de doutorado relacionado pareados com os genes spxA e dpr que serão acompanhados por uma rigorosa caracterização fenotípica. Em acréscimo, foi proposto empregar o ensaio de transcrição in vitro para investigar se os genes escolhidos são direta ou indiretamente regulados por Spx. (AU)

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O diabetes experimental ocasiona drástica atrofia prostática e prejuízo da atividade secretória da próstata. Esse prejuízo é associado ao desequilíbrio na cinética epitelial, remodelamento da matriz extracelular e mudanças morfofuncionais das células estromais prostáticas. Há também um aumento na incidência de neoplasias intraepiteliais (PIN) e lesões malignas na próstata após 3 meses de diabetes experimental. Entretanto, a associação entre o diabetes e o câncer de próstata ainda é controversa. Essas alterações são relacionadas à falta de insulina, queda nos níveis séricos de testosterona e baixos níveis intracelulares de glicose. Contudo, é importante não negligenciar os efeitos da hiperglicemia que indiretamente culminam no aumento do estresse oxidativo. A melatonina (MLT), além de ser um potente antioxidante e antiinflamatório, possui propriedades antiproliferativas as quais são bem descritas para células cancerígenas prostáticas. As células tumorais prostáticas dependentes de andrógenos exibem sensitividade diferente à MLT comparadas às linhagens independentes. Estudos in vivo realizados pela bolsita demonstram o papel antioxidante da MLT na próstata de animais diabéticos por curto e longo prazo. Essa mesma pesquisa demonstrou que a administração prolongada de baixas doses de MLT a ratos diabéticos por dois meses acarretou diminuição dos níveis apoptóticos, aumento dos níveis proliferativos, normalização da frequência de células AR-positivas e níveis séricos de testosterona. Há uma escassez de trabalhos com células tumorais prostáticas em condições hiperglicêmicas. Além da importância do estágio no exterior para a carreira de pesquisador e melhor qualidade da investigação, torna-se, portanto relevante analisar a ação isolada da MLT em células dependentes de andrógenos (LNCaP) e independentes (PC3) em meio hiperglicêmico para melhor compreensão dos nossos dados já obtidos in vivo. Este estudo irá analisar se o meio hiperglicêmico interfere na ação da MLT na resposta proliferativa e apoptótica de células tumorais LNCaP e PC3. O uso de duas linhagens celulares diferentes irá esclarecer se esses mecanismos são regulados por sinalização androgênica nessas condições. (AU)

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Produtos de glicação avançada (AGE) encontram-se aumentados no diabete melito (DM) e predizem o risco de doença aterosclerótica, independentemente de outros fatores de risco. Albumina-AGE induz geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), o que está vinculado à diminuição de ABCA-1 e o acúmulo de colesterol em macrófagos. Nossa hipótese é de que os efeitos da albumina AGE em prejudicar o transporte reverso de colesterol (TRC) podem ser prevenidos pelo silenciamento ou knocking out do receptor para AGE (RAGE). Albumina controle (C) de indivíduos saudáveis e albumina AGE de pacientes diabéticos tipo 1 (DM1) e tipo 2 (DM2) com controle glicêmico inadequado (HbA1c > 8%) foram isoladas por HPLC seguida de purificação por extração alcoólica. Macrófagos isolados da medula óssea de camundongos knockout para RAGE (RAGE-KO) e selvagens (wild-type - WT) e células THP-1 transfectadas com siRNA-RAGE tratados por 48h com albumina C, DM1 e DM2 para medir a expressão da NOX-4 (NADPHoxidase4) e do RAGE (Ager), e também do efluxo de colesterol mediado por apo A-I e subfrações de HDL. Nas células THP-1 tratadas com o siRNA-RAGE foi observado um silenciamente de 71% na expressão do RAGE. Nessas células, a expressão do RAGE e da NOX-4 foi reduzida após o tratamento com albumina DM1 ou DM2 e não houve alteração após o tratamento com albumina C quando comparado com as células transfectadas com scramble siRNA. Em macrófagos isolados da medula óssea de animais WT, o efluxo de colesterol mediado por apo A-I e subfrações de HDL foi reduzido após o tratamento com albumina DM1 ou DM2 quando comparado com albumina C. Essa redução não foi observada quando macrófagos isolados de animais RAGE-KO foram tratados com albumina DM1 ou DM2 em comparação ao tratamento com albumina C. A indução do estresse oxidativo e o prejuízo no efluxo de colesterol em macrófagos suscitados após o tratamento de albumina AGE isolada de pacientes diabéticos pode ser prevenida pela inibição do RAGE. O uso de bloqueadores de AGE podem ser úteis na prevenção de distúrbios do TRC e da aterosclerose na vigência do diabetes mal controlado. Com intuito de continuar essa investigação, nós planejamos transfectar células THP-1 com RNA de inferência para RAGE ou tratar células J774 com anti-RAGE para concluir os experimentos de expressão gênica. Além disso, macrófagos da medula óssea isolados de animais RAGE-KO e WT serão utilizados para analisar o acúmulo intracelular de lípides com Oil Red O. (AU)

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Mudanças epigenéticas modificam o padrão de expressão gênica sem alterar a sequência do DNA, sendo que os três mecanismos mais importantes são metilação do DNA, metilação/acetilação das histonas e silenciamento de microRNA. A inflamação é uma resposta fisiológica complexa de um organismo a estímulos nocivos. A inflamação crônica é causa subjacente de doenças cardiovasculares, pulmonares e diabetes. Poluentes do ar ambiente provocam a ruptura do equilíbrio homeostático dos organismos a elas expostos, gerando estresse oxidativo celular e estabelecendo inflamação. O objetivo do presente trabalho é identificar diferenças no padrão de metilação das regiões promotoras dos genes das citocinas TNFL (inflamatória) e IL-10 (antiinflamatória), entre indivíduos já identificados como suscetíveis ou não à poluição, no que diz respeito à resposta inflamatória. O banco de DNA a ser utilizado provém de um grupo de profissionais da cidade de São Paulo: controladores de tráfego da CET, taxistas e profissionais do Instituto Florestal. A carga individual de PM2,5 recebida foi medida por 24 horas, em 4 ocasiões separadas por uma semana e, nas mesmas ocasiões, todos os indivíduos passaram por exames clínicos e laboratoriais no HCFMUSP. A mensuração de metilação nos promotores dos genes escolhidos será feita por pirossequenciamento, após derivatização da citosina por bissulfito de sódio: (AU)

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Este projeto é uma continuidade da linha de pesquisa, que vem sendo apoiada pela FAPESP (2013/00976-8; 2013/24252-9; 2010/17534-0; 2010/16115-3; 2010/06395-9; 2006/56435-1; 2006/56759-1; 2003/01233-7) e cujo objetivo é o estudo sistemático das propriedades estruturais e cinéticas da (Na, K)-ATPase do tecido branquial de diferentes espécies de caranguejos e camarões, com o objetivo de se tentar estabelecer um modelo para a adaptação dos crustáceos a ambientes de diferentes salinidades. A manutenção da osmolalidade da hemolinfa dos crustáceos é atribuída à (Na, K)-ATPase e este mecanismo de adaptação sugere que as respostas dos crustáceos envolvem uma rápida ativação do transporte de íons que deve ser primária a qualquer outra resposta fisiológica deste animal. Com relação ao projeto em tela pretende-se investigar a sinalização celular vinculada à regulação da (Na,K)-ATPase de Cardisoma guanhumi bem como suas consequências diretas na captação de NaCl através das brânquias durante a aclimatação a ambientes hiposalinos (abaixo de 300 salinidade) e a ambientes marinhos (cerca de 330 salinidade). Para isso serão realizados os seguintes estudos: 1) preparação da (Na,K)-ATPase do tecido branquial de C. guanhumi. 2) caracterização cinética da atividade da Na,K-ATPase de C. guanhumi em relação aos ligantes ATP, PNPP, sódio, potássio, magnésio, amônio e ouabaína. 3) análise da expressão da Na,K-ATPase branquial de C. guanhumi. 4) localização subcelular da Na,K-ATPase branquial de C. guanhumi através de ensaios imunohistoquímicos. 5) quantificação das atividades das enzimas que participam do estresse oxidativo em animais aclimatados em diferentes condições. 6) Estudo de fosforilação da Na,K-ATPase branquial de C. guanhumi. (fosforilação da enzima em condições adequadas de íons; efeito de poliaminas na estabilidade da fosfoenzima; efeito de poliaminas na desfosforilação da enzima na presença de potássio; análise por western blot do FXYD2 após fosforilação por PKA e PKC; preparação e extração do FXYD2 fosforilado). 7) Regulação da atividade da (Na,K)-ATPase branquial de C. guanhumi. pelo FXYD2 exógeno. 8) Estudo da ação de poliaminas na atividade da (Na,K)-ATPase. 9) Padronização de um protocolo de cultura de células branquiais. 10) Correlacionar o FXYD2 com PKA estimuladas por poliaminas e com a atividade da (Na,K)-ATPase branquial de C. guanhumi em diferentes condições de salinidade usando cultura de células branquiais. 11) análise da atividade da Na,K-ATPase branquial de C. guanhumi aclimatado em diferentes condições (salinidade, amônio, nitrito, metais pesados). (AU)

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Diversos estudos demonstram a segurança para a saúde humana do uso de estatinas em pacientes hipercolesterolêmicos (atualmente cerca de 50 milhões de usuários nos EUA). Todavia, cerca de 10% destes pacientes desenvolvem efeitos adversos em músculos e outros tecidos. Os mecanismos de toxicidade das estatinas parecem envolver morte celular mediada por disfunções mitocondriais associadas a alterações na homeostase intracelular de cálcio e inibição da ²-oxidação seguidos de estresse oxidativo. Neste contexto, nosso grupo demonstrou que sinvastatina (1 ¼M) quando adicionada a biópsias de músculo esquelético diminui a produção de ubiquinona (Co-Q10) em cerca de 30% e inibe a respiração mitocondrial fosforilativa (25%) devido a diminuição de transferência de elétrons pelos complexos respiratórios I e II. As alterações de função mitocondrial eram dependentes de aumento de oxigênio reativo (cerca de 100%) e se mostraram sensíveis a adições de L-carnitina ou Co-Q10 que, além de componente da cadeia mitocondrial de transporte de elétrons, tem também importante papel biológico como sequestrador de radicais livres. A maioria dos resultados da literatura indicando que as estatinas causam estresse oxidativo mitocondrial são provenientes de experimentos in vitro usando mitocôndrias ou tecidos de animais não hipercolesterolêmicos, ou seja, com expressão normal do receptor de LDL (LDLr). Assim, nossa proposta é aprofundar o entendimento dos mecanismos de toxicidade muscular causada pelas estatinas em camundongos nocaute para o LDLr (LDLr-/-) que mimetizam a hipercolesterolemia familiar em humanos. Analisaremos se, nestes camundongos, o estresse oxidativo mitocondrial sinalizaria para aumento de expressão e atividade de sistemas antioxidantes celulares. Além disso, avaliaremos os componentes existentes no lipidoma para a caracterização de possíveis biomarcadores. (AU)

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A Doença Inflamatória Intestinal (DII) possui incidência crescente no mundo todo e é caracterizada como processo inflamatório idiopático, crônico, com recidiva do trato gastrointestinal. A pesquisa de novos medicamentos para a DII, ainda sem cura, deve considerar aspectos interdisciplinares, especialmente quanto aos mediadores que participam da resposta anti-inflamatória de novos compostos potencialmente úteis para tratar a DII em humanos. Recentemente, nosso grupo de pesquisa demonstrou que a 6,7-dihidroxi-4-metilcumarina (4-ME), um derivado cumarínico natural, apresenta potente atividade anti-inflamatória intestinal, a qual foi relacionada às suas propriedades antioxidante e inibitória da produção de citocinas pró-inflamatórias. Com base nas informações apresentadas, o presente estudo tem como objetivos identificar os mecanismos de ação antioxidantes que participam da resposta anti-inflamatória intestinal produzida pela 4-ME no modelo de inflamação intestinal induzida por TNBS em ratos e caracterizar por técnicas de biofísica molecular se existe interação direta deste composto com os principais mediadores do estresse oxidativo envolvidos com o processo inflamatório intestinal, como a glutationa peroxidase (GPx) e a proteína inibitória ºB (IºB). Para tal, serão realizados estudos no modelo de inflamação intestinal induzida por TNBS em ratos através da quantificação de radicais livres; da determinação fatores de transcrição, da expressão gênica e da atividade enzimática de fatores pró e antioxidantes, tais como a lipoxigenase, cicloxigenase, mieloperoxidase, superóxido dismutase, catalase, enzimas dependentes de glutationa, NF-ºB e Nrf2 e, finalmente, avaliar os paramentos da interação de 4-ME com GPx e IºB pela técnica de espectroscopia de fluorescência por meio de titulação fluorimétrica, cálculo das constantes de associação e verificação do número de sítios de ligação existentes para a 4-ME nas proteínas. Com o presente trabalho, espera-se melhor elucidar o principal mecanismo de ação envolvido no efeito anti-inflamatório e antioxidante da 4-ME. (AU)

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A disfunção endotelial é caracterizada principalmente pela diminuição da capacidade das células endoteliais em liberar óxido nítrico (NO). Há evidências de que a diminuição da biodisponibilidade do NO contribui para o desenvolvimento e progressão da hipertensão arterial e aterosclerose, as quais podem levar ao desenvolvimento de doenças isquêmicas cardíaca, infarto do miocárdio e até insuficiência cardíaca. Um dos fatores que contribuem para disfunção endotelial é a presença de elevados níveis intracelulares de ânion superóxido (O2-), o qual reage com NO e forma peroxinitrito (ONOO-), diminuindo os níveis de NO. Os complexos de rutênio estão sendo estudados como doadores de NO, os quais são muito atrativos por apresentarem baixa toxicidade e serem ativos em suas formas estáveis em condições fisiológicas. Em estudos prévios foi demonstrado que o composto cis-[Ru(H-dcbpy-)2(Cl)(NO2-)] gera NO em artéria de ratos e é capaz de inativar o O2- formado no meio extracelular. Assim, nossa hipótese é que este composto pode inativar o O2- formado no meio intracelular e aumentar os níveis de NO. Para testar esta hipótese, será utilizado o modelo de cultura de células endoteliais estimuladas com angiotensina II, onde será possível obter células endoteliais disfuncionais com elevadas concentrações de O2- intracelular. Este estudo permitirá avaliar a ação farmacológica do composto cis-[Ru(H-dcbpy-)2(Cl)(NO2-)] para reverter e/ou prevenir a disfunção endotelial, e a caracterização farmacológica dos efeitos dependentes da remoção do O2- e liberação do NO induzido por esta droga. (AU)

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Recentemente, foi demonstrado que a intensidade dos efeitos adversos das técnicas de clareamento dental sobre o complexo dentino-pulpar está diretamente relacionada com o grupo de dentes submetido a este procedimento. Dessa forma, o objetivo do presente estudo será avaliar a eficácia e citotoxicidade de protocolos de clareamento experimentais de acordo com a espessura de esmalte/dentina do substrato dental. Para isto, serão usados discos de dentes bovinos, os quais devem apresentar espessuras de esmalte e dentina similares aos incisivos inferiores e pré-molares superiores humanos. Para análise da eficácia clareadora, os discos serão manchados e submetidos ao clareamento com um gel contendo 10% de H2O2, aplicado por 3x 15, 1x 15 ou 1x 5 minutos sobre o esmalte. Como controle positivo, um gel com 35% de H2O2 será aplicado por 3x 15 minutos. No controle negativo, nenhum tratamento será realizado sobre os discos. Serão realizadas sessões de clareamento com intervalos de 24 horas, até a obtenção de um valor de L=14,00 ±1, por meio de um espectrofotômetro de reflexão-UV de acordo com o sistema CIE L*a*b*. Para avaliação da citotoxicidade trans-amelodentinária, os discos serão adaptados em câmaras pulpares artificiais, sendo as células pulpares humanas semeadas na superfície de dentina dos discos. Protocolos selecionados de acordo com a análise da eficácia clareadora serão realizados sobre o esmalte, sendo avaliadas a viabilidade (MTT) e morfologia celular (MEV), imediatamente e 72 horas pós-tratamento clareador, além do estresse oxidativo celular gerado (fluorescência), atividade de fosfatase alcalina (ensaio de timolftaleína) e deposição de nódulos de mineralização (alizarin red). A quantificação do total de H2O2 capaz de se difundir pelos discos também será realizada (violeta leuco-cristal/peroxidase). Os dados numéricos obtidos através da aplicação dos protocolos laboratoriais serão submetidos à análise estatística específica. (AU)

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O processo inflamatório associado à cólica em equinos apresenta com frequência, além da manifestação local, repercussão sistêmica com comprometimento de órgãos distantes ao foco de lesão. Dentre os sistemas envolvidos, o cardiovascular ainda é pouco estudado. Diante disto, objetivou-se, na presente proposta, estudar com maior profundidade a resposta inflamatória sistêmica, o estresse oxidativo e as alterações em metaloproteinases de equinos com obstrução experimental do cólon menor, assim como avaliar a resposta sobre biomarcadores de lesão cardíaca. As análises serão efetuadas em amostras de sangue e líquido peritoneal colhidas em diferentes momentos do procedimento cirúrgico realizado em experimentos anteriores (Fapesp no 2009/07284-9 e FAPESP no 2010/15046-8). A resposta inflamatória será avaliada por meio da determinação das citocinas IL-1², IL-6, IL-8, IL-10 e TNF-±, assim como de metaloproteinase-2 e -9 (MMP-2 e MMP-9); o estresse oxidativo será avaliado mediante determinações de malondialdeído (MDA), produto proteico de oxidação avançada (AOPP), vitamina A, vitamina E e glutationa (GSH); e lesões do miocardio serão avaliadas por meio de determinações de Troponina I, Proteína C Reativa e Creatina Quinase isoforma MB (CK-MB). O líquido peritoneal também será analisado para a presença de MMP-2 e MMP-9. Os valores obtidos serão analisados por meio de Análise de Variância (ANOVA) e os valores médios comparados pelo teste de Tukey. Para todas as análises realizadas será estabelecido o nível de significância igual a p<0,05. (AU)

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Neste projeto pretendemos desenvolver compostos de metais de transição luminescentes do tipo cis-[Ru(a-diimina)2(Apy)2]2+, onde Apy= 4-aminopiridina e 3,4-aminopiridina para atuarem tanto no diagnóstico quanto no tratamento da Doença de Alzheimer (DA). A DA é uma desordem neurodegenerativa progressiva e lenta que danifica principalmente a memória e a função cognitiva em idosos. A disfunção neuronal é caracterizada pelo acúmulo do peptídeo b-amilóide no cérebro que leva à sua agregação em oligômeros e fibrilas insolúveis, resultando na formação de placas senis. Uma vez que os mecanismos detalhados que fundamentam a patogênese da DA ainda não são claros, os medicamentos disponíveis atuam no sistema colinérgico da doença pela inibição da enzima acetilcolinesterase. Estes medicamentos aliviam os sintomas, mas não curam a doença. Os compostos propostos neste projeto apresentam as características necessárias para atuarem tanto no diagnóstico quanto no tratamento da DA. A presença de um fragmento planar e hidrofóbico, {Ru(phen)}2+ e carga total positiva, são requisitos necessários para interação do complexo com o peptídeo b-amilóide. As alterações nos movimentos rotacionais e conformacionais durante o processo de agregação do b-amiloide repercutirá nas propriedades luminescentes dos complexos viabilizando o mapeamento do processo de agregação e desagregação deste peptídeo. Em adição às aminopiridinas, atuam nas células neuronais protegendo-as tanto dos efeitos excitatórios quanto da hipóxia e atuando em diferentes alvos intracelulares incluindo a inibição da enzima AChE e estresse oxidativo, e disfunção de íons Ca2+. Esperamos que a coordenação da Apy ao fragmento {Ru(phen)2}2+ potencialize o efeito terapêutico das Apy. O potencial terapêutico dos complexos propostos no avanço da neurodegeneração será investigado pela alteração da resposta luminescente do complexo com a neurotoxicidade induzida pelo peptídeo b-amilóide, ou seja, pela capacidade inibidora do complexo frente à formação do peptídeo b-amiloide e/ou pela inibição da agregação do b-amiloide. A atividade inibidora enzimática dos complexos frente à enzima acetilcolinesterase e no estresse oxidativo causado pelas espécies reativas do oxigênio também serão investigados. Os complexos propostos são convenientes para estes propósitos devido à simplicidade de síntese e à estabilidade térmica e luminescência sensível a alterações do meio. Espera-se assim, que esta pesquisa abra novas possibilidades para o controle ótico da atividade de grupos selecionados para estudos neurológicos. (AU)

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O endotélio é uma monocamada de células que se estende sobre a superfície interna vascular, estas por sua vez são responsáveis pela modulação do tônus vascular. Por meio da liberação do óxido nítrico (NO), o endotélio apresenta importante função protetora contra as doenças cardiovasculares, produzindo vasodilatação por diversos mecanismos e gerando uma serie de outros efeitos, visto que em altas concentrações pode produzir efeitos tóxicos às células. Contudo, a disfunção endotelial é caracterizada principalmente pela diminuição da capacidade das células endoteliais em liberar NO, que pode ser decorrente da reação com ânion superóxido (O2-) e formação de peroxinitrito (ONOO-). No entanto, em várias condições patológicas como na hipertensão arterial, ocorre a disfunção endotelial, gerando assim um desequilíbrio entre a produção/liberação de fatores vasodilatadores e vasoconstritores, ocorrendo um predomínio dos fatores contráteis, induzindo aumento da resistência vascular periférica e hipertrofia da parede vascular. Em estudos prévios, foi verificado que complexos de rutênio podem inativar O2- e também liberar NO. Desta forma, este estudo pretende avaliar por meio de estudos funcionais e cultura de células o potencial da droga cis-[Ru(bpy)2(NO2)(NO)](PF6)2 como estratégia farmacológica para reverter e/ou prevenir a disfunção endotelial encontrada no modelo de hipertensão arterial dois rins um clip (2R-1C) e em células endoteliais em cultura estimuladas com angiotensina II, bem como realizar a caracterização farmacológica dos efeitos dependentes da remoção do O2- e liberação do NO induzidos por esta droga. (AU)

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A associação entre elevadas concentrações de ferritina sérica e a sobrecarga de ferro na resistência à insulina vem sendo discutida na literatura científica. A sobrecarga de ferro, por meio do seu efeito pró-oxidante, contribui para o desenvolvimento de algumas doenças sistêmicas. Estudos recentes sugerem que o estresse oxidativo provocado pelo excesso de ferro pode causar injúria às células ²-pancreáticas, reduzindo a produção e secreção de insulina, contribuindo para o desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2. Objetivo: Investigar a associação entre status em ferro e resistência à insulina em adultos e idosos residentes no município de São Paulo. Metodologia: Utilizar-se-á dados provenientes do estudo ISA Capital-2014. Serão avaliados adultos e idosos, de ambos os sexos, residentes no município de São Paulo, correspondendo a 629 indivíduos. Os dados socioeconômicos, de estilo de vida e histórico familiar de morbidade, foram obtidos por meio da aplicação de um questionário estruturado. Foram realizadas aferições antropométricas (peso, estatura e circunferência da cintura), de pressão arterial e aplicados dois recordatório de 24h, para obter a estimativa do consumo habitual. Serão avaliados biomarcadores do status de ferro (ferritina sérica, transferrina, hemograma) e a resistência à insulina por meio do modelo de avaliação da homeostase da resistência à insulina modelo de avaliação da homeostase (HOMA-IR). A associação entre o status de ferro e resistência insulínica será avaliada por meio de modelos de equação estrutural. (AU)

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As espécies reativas do oxigênio (ROS) são formadas em reações decorrentes do metabolismo, como a fotossíntese e a respiração e agem como moléculas sinalizadoras que regulam muitos processos celulares, como crescimento, desenvolvimento e a respostas das plantas ao estresse. Plantas CAM apresentam capacidade de lidar com ambientes altamente mutáveis em virtude da flexibilidade reversível de adaptações morfológicas e fisiológicas a múltiplos estresses. Contudo, pouco se sabe sobre a via de sinalização de ROS em plantas com metabolismo CAM. Sabe-se, porém, que a produção de ROS é limitada em plantas CAM. Este projeto tem como objetivo encontrar resposta para a seguinte questão: a indução do CAM é uma estratégia para amenizar o estresse oxidativo? Para responder a essa questão consideramos várias hipóteses-chave a serem testadas: metabolismo CAM impede a produção de ROS? Plantas CAM apresentam sistema eficiente de resposta antioxidante? NO e hormônios vegetais interagem na regulação redox durante a indução do CAM? Para responder essas perguntas utilizaremos como modelo de estudo a bromélia epífita Guzmania monostachia, espécie essa capaz de ser induzida ao CAM de forma reversível, capaz de reverte à condição C3, o que poderá propiciar a obtenção de resultados bastante interessantes e inéditos sobre a importância das ROS durante a indução do CAM. Espera-se que com o desenvolvimento deste projeto possamos discutir sobre quais seriam os mecanismos de reajuste da homeostase redox em plantas CAM. As redes regulatórias, as quais controlam a produção e eliminação de ROS durante a indução do CAM, serão caracterizadas a partir de mudanças do estado C3 para CAM em folhas de diferentes estágios do desenvolvimento, provenientes de plantas em fases ontogenéticas distintas. A produção de ROS como o sistema de resposta antioxidante varia de acordo com o tipo e a severidade do estresse, uma vez que o funcionamento do sistema de resposta antioxidante depende, em parte, do tipo de fotossíntese das plantas. Desta forma, especial atenção será conferida à importância do sistema de resposta antioxidante durante a transição C3-CAM, visto que os antioxidantes apresentam um papel crucial na regulação redox. Buscar-se-á evidenciar as possíveis interações existentes entre os níveis endógenos dos hormônios vegetais e ROS durante a indução do CAM, uma vez que é conhecido que o sistema de sinalização das ROS está altamente integrado com as redes de sinalização dos hormônios vegetais. Os resultados obtidos com o presente projeto contribuirão para maior compreensão das estratégias fisiológicas e bioquímicas utilizadas durante o desenvolvimento dessa bromélia epífita quando exposta a condições ambientais adversas. Tais conhecimentos poderão futuramente ser utilizados como ferramentas biotecnológicas importantes, uma vez que a acumulação de ROS devido a alterações ambientais é uma das principais causas de perda de produtividade das culturas em todo o mundo. (AU)

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PROJETO 1: A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica via final comum de diversas doenças cardíacas que cursa com sintomas como fadiga muscular, dispneia e redução da qualidade de vida. Para melhorar a capacidade respiratória e funcional desses pacientes estratégias voltadas ao fortalecimento muscular podem ser utilizadas, como o treinamento muscular inspiratório e o fortalecimento muscular periférico por meio do treinamento resistido dinâmico. Objetivo: Avaliar os efeitos de um programa combinado de treinamento muscular inspiratório e fortalecimento muscular periférico na funcionalidade e na qualidade de vida de indivíduos com insuficiência cardíaca avançada e avaliação de estresse oxidativo, inflamação e alteração no DNA e RNA.População: 50 pacientes com insuficiência cardíaca avançada (classe funcional III e IV da NYHA) serão incluídos no estudo. PROJETO 2: A apneia obstrutiva do sono (AOS) afeta de 10% a 25% dos adultos. A pressão positiva contínua de vias aéreas (CPAP) é o tratamento de escolha da SAOS moderada a grave. Porém, a adesão à CPAP é muito variada, sendo que a interface paciente-aparelho pode interferir na adesão, conforto e eficiência da CPAP. Objetivos: (1) determinar qual a via preferencial nas vias aéreas, (2) analisar os efeitos da respiração oral e oronasal sobre a mucosa nasal e de vias aéreas e (3) os efeitos de cada interface (máscara nasal e orofacial) sobre o epitélio nasal e de vias aéreas desses pacientes com a CPAP; e (4) avaliar o estresse oxidativo, inflamação e alteração no DNA e RNA.População: 40 pacientes com AOS moderada e grave recrutados no Ambulatório de Sono do Instituto do Coração - Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.PROJETO 3: A inalação de fumaça do cigarro é diretamente nociva ao epitélio respiratório, altera o batimento ciliar e a produção e composição do muco. Tudo isso leva a alterações morfológicas no epitélio do trato respiratório e induz perda de cílios, metaplasia e queratinização de células caliciformes, seguido de espessamento do epitélio respiratório e de inflamação da submucosa. Objetivo: Avaliar os efeitos do tabagismo e da cessação do tabagismo sobre: (1) os mecanismo de defesa das vias aéreas e (2) avaliar o estresse oxidativo, inflamação e alteração no DNA e RNA. População: Tabagistas, não-tabagistas e ex-tabagistas, de ambos os sexos, com idade entre 18 e 70 anos, recrutados na Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISE:Pressões respiratórias máximas por manovacuômetro, teste de função pulmonar por espirometria, capacidade functional por meio do teste da caminhada dos seis minutos, força muscular periférica por dinamômetro, qualidade de vida por questionários (Minnesota, SF-36, Epworth, Pittsburgh, SNOT20, IPAQ), classificação de atividade física por acelerômetros, variabilidade da frequência cardíaca e eventos cardíacos por estudo eletrofisiológico, transporte mucociliar nasal por teste da sacarina, propriedades físicas do muco por ângulo de contato e transportabilidade do muco por tosse e inflamação nasal e de vias aéreas por pH e número total de células em lavado nasal e pH em condensado do ar exalado. Estresse oxidativo, inflamação sistêmica e alterações de DNA e RNA por enzimaimunoensaio, teste do cometa e PCR-microarray. (AU)

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A grande maioria dos países desenvolvidos possui políticas de prevenção e limites de exposição recomendados aos resíduos de gases anestésicos. Ressalte-se que não existem normas quanto aos valores limite dessa exposição ocupacional em nosso país. Assim, o presente projeto foi delineado com o objetivo de correlacionar as concentrações dos resíduos de gases anestésicos em salas cirúrgicas ainda sem adequado sistema de exaustão e renovação de ar, sendo representativo da maioria dos centros cirúrgicos no Brasil, com os possíveis efeitos tóxicos em residentes médicos ocupacionalmente expostos. O estudo será realizado no Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP, em 40 médicos residentes pareados, sendo 20 sem exposição (controle) e 20 residentes expostos a três anos aos resíduos de gases anestésicos. As concentrações dos resíduos de gases anestésicos isoflurano, sevoflurano, desflurano e óxido nitroso serão detectadas por espectrofotometria no centro cirúrgico. Para avaliação do estresse oxidativo, analisar-se-ão os danos oxidativos no genoma (teste do cometa e cromatografia), a peroxidação lipídica (malonaldeído e 4-hidroxinonenal) e a oxidação em proteínas (proteínas carboniladas), além da capacidade antioxidante total (TAP). A resposta imunológica será avaliada por diversas citocinas inflamatórias e de perfil T helper por citometria de fluxo. Obter-se-ão informações das concentrações de resíduos de gases anestésicos em centro cirúrgico e de seus possíveis efeitos no estresse oxidativo e na resposta imunológica de residentes médicos. Assim, nossos dados contribuiriam para se conhecer essas concentrações em salas cirúrgicas e qual o impacto dessa exposição em profissionais jovens recentemente expostos. (AU)

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Pretendemos aprofundar o estudo sobre o papel desempenhado pela NAD(P)H oxidase na fisiologia e fisiopatologia das células secretoras de insulina. O ponto alto deste projeto será a implantação de métodos de investigação mais avançados com o intuito de identificar quais os radicais produzidos e em qual compartimento celular. Para tanto, utilizaremos sensores geneticamente modificados (vetores adenovirais) em cultura de ilhotas pancreáticas e em linhagens celulares ratos, além de implementarmos estudos com ilhotas de camundongos knockout para o gene da subunidade gp91phox (gp91phox-/-) e da p47phox (p47phox-/-). Assim, objetivamos identificar detalhadamente o papel da NAD(P)H oxidase na secreção de insulina estimulada por ácidos graxos e glicose; investigar se alterações da membrana plasmática promovida pela HDL alteram a atividade da NAD(P)H oxidase; avaliar se o excesso da ingestão de lipídios e sacarose alteram a produção de EROs pela NAD(P)H oxidase; investigar as vias envolvidas no efeito protetor do EPA e DHA em ilhotas pancreáticas (cultura primária) e linhagem celular INS-1E expostas cronicamente a agentes agressores como ácidos graxos saturados e AGEs; investigar o acoplamento elétrico entre as células excitáveis de ilhotas pancreáticas intactas isoladas de diferentes espécies; avaliar se a NAD(P)H oxidase tem como função o fornecimento de NAD+ para o bom funcionamento da glicólise nas células produtoras de insulina; avaliar o efeito do bloqueio do sistema renina-angiotensina (SRA) sobre a atividade da enzima NAD(P)H. em animais diabéticos/obesos (ob/ob) avaliando o estresse de retículo e a expressão de TLRs. (AU)

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As dislipidemias têm sido um achado frequente e se manifestado cada vez mais cedo na população em consequência do aumento do número de obesos. As estatinas são inibidores da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase (HMG-CoA redutase) e são, portanto, responsáveis por diminuir o colesterol total, principalmente o LDL-colesterol. A rosuvastatina é uma estatina de última geração e apresenta várias vantagens farmacológicas e efeitos inibitórios superiores em relação às outras estatinas. A vitamina C exerce importante função na integridade espermática e na fertilidade, atua como agente antioxidante contra o estresse oxidativo testicular e pode aumentar as concentrações séricas de testosterona. Considerando-se o uso de substâncias hipolipemiantes por crianças e os efeitos reprodutivos adversos imediatos e tardios promovidos pela administração de rosuvastatina a ratos pré-púberes, como observado em trabalho anterior, por nós realizado (Leite et al. submetido 2013) e o importante papel desempenhado pela vitamina C na reprodução, propomos o presente estudo experimental em que ratos jovens serão expostos à rosuvastatina a partir do dia pós-natal (DPN) 23 até o DPN53, avaliando-se parâmetros reprodutivos imediatos e tardios sobre o sistema genital e a fertilidade das gerações F0 e F1. A escolha da "janela" de exposição se justifica pela tentativa de mimetizar a situação humana em que algumas crianças necessitam da droga durante a infância e adolescência. Para tanto, ratos recém-desmamados serão divididos em seis grupos experimentais e receberão solução salina (veículo), 3 ou 10 mg/Kg/dia de rosuvastatina na presença ou ausência de vitamina C na dose de 150 mg/dia, do DPN23 até o DPN53, quando parte dos animais serão eutanasiados e avaliados quanto aos níveis hormonais, aspecto histológico das gônadas e epidídimo e atividade de enzimas antioxidantes. A outra parte dos ratos será mantida até atingirem a maturidade sexual, quando serão avaliados o comportamento sexual, níveis hormonais, produção, reserva e qualidade dos espermatozoides, ensaio cometa, histologia de testículo e epidídimo, imunohistoquímica e western blot para receptores de andrógenos e para a proteína Rab11a, e teste de fertilidade natural. Na geração F1, a prole masculina será avaliada em relação as análises espermáticas, dosagens hormonais, ensaio cometa, morfologia de testículo e epidídimo, comportamento sexual e teste de fertilidade natural, e a prole feminina será avaliada quanto ao ciclo estral, histologia de ovários e útero, TUNEL para identificação de apoptose no ovário, comportamento sexual e teste de fertilidade natural. Pretende-se que, além da formação de recursos humanos qualificados em Biologia e Toxicologia da Reprodução, novos conhecimentos sejam adquiridos sobre os efeitos adversos dessa estatina sobre a fertilidade das gerações F0 e F1 e sobre os possíveis efeitos protetores da vitamina C para o desenvolvimento reprodutivo e a fertilidade dessas mesmas gerações, divulgando-se os resultados por intermédio de publicações em revistas internacionais e indexadas de impacto, bem como em comunicações em eventos científicos da área. (AU)

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O Mycobacterium tuberculosis (MTB), principal agente da tuberculose (TB), é responsável pela morte anual de dois a três milhões de pessoas no mundo e por prejuízos econômicos globais de aproximadamente 12 bilhões de dólares ao ano. Atualmente, uma das grandes preocupações mundiais é o aumento do número de casos de tuberculose multi-resistente a fármacos (MDR-TB) e tuberculose extensivamente resistente a fármacos (XDR-TB) devido à elevada taxa de mortalidade, dificuldade de tratamento e os altos custos envolvidos. Estima-se que, no mundo, o número de pessoas infectadas com MTB resistente a fármacos de primeira e segunda linha seja de 50 milhões. Atualmente, apenas o fármaco bedaquilina é aprovado pela agência norte americana - Food and Drug Administration (FDA) - para tratamento da MDR-TB e XDR-TB, fato este que justifica a necessidade da descoberta de outros agentes ao arsenal terapêutico. Compostos contendo a função N-óxido como os furoxanos e as quinoxalinas tem sido descritos como protótipos para descoberta de novos fármacos anti-TB. Nosso grupo de pesquisa identificou previamente compostos furoxânicos com atividade contra cepas H37Rv e isolados clínicos multi-resistentes a fármacos. Estes compostos apresentaram valores de concentração inibitória mínima entre 1.02 e 65.4 ¼M em isolados clínicos resistentes (MDR-TB e XDR-TB) e índice de seletividade entre 10.4 e 105. Além disso, foram capazes de inibir a atividade das bombas de efluxo do MTB, associadas à resistência aos fármacos. Outra classe de compostos contendo a função N-óxido são as quinoxalinas 1,4-dióxido. Estes compostos heterocíclicos, bioredutíveis em condições de hipóxia, são capazes de aumentar o estresse oxidativo pelo aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Essa classe tem sido descrita como útil ao tratamento não apenas de MDR-TB e XDR-TB, mas também de TB latente. Nesse contexto, sintetizaremos e caracterizaremos a estrutura química de duas séries de compostos: furoxanicos (série 1) e quinoxalínicos (série 2) planejados pela estratégia de hibridação molecular. Estes compostos inéditos serão ainda avaliados contra MTB usando cepas H37Rv e isolados clínicos multiresistente caracterizados genotipicamente e fenotipicamente pelo laboratório de micobactérias da FCF-UNESP Araraquara. (AU)

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A esquizofrenia é um distúrbio psiquiátrico grave marcado por sintomas variados como alucinação, embotamento afetivo e déficits cognitivos que são incapacitantes e afetam profundamente a vida do portador. Manifesta-se ao final da adolescência e início da vida adulta e apresenta um período prodrômico em que os sintomas começam a aparecer, porém de maneira amena, exceto pelo isolamento social evidente acarretando em importantes consequências para o portador. Trata-se de um transtorno multifatorial cujas causas ainda não estão totalmente claras, mas acredita-se que eventos ocorridos no início do desenvolvimento possam contribuir de forma importante para a etiologia da doença. Um exemplo desses eventos é o estresse no período perinatal. Em ratos, a privação materna no 9º dia pós-natal produz efeitos significativos no neuro-desenvolvimento que se manifestam por alterações comportamentais no adulto, semelhantes a aspectos da esquizofrenia, de modo que tal aplicação tem sido utilizada como modelo experimental de esquizofrenia. Contudo, os mecanismos envolvidos ainda não são totalmente conhecidos, tornando-o um amplo campo para estudos futuros. Portanto, o presente projeto visa compreender os efeitos do estresse neonatal sobre o processo de estresse oxidativo, que é um fenômeno bioquímico que vem sendo, recentemente, relacionado à esquizofrenia; estudaremos, também, alguns comportamentos comumente relacionados à esquizofrenia. Dessa forma, espera-se que o conhecimento sobre a possível relação entre alterações no estresse oxidativo e alterações comportamentais contribua para um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na esquizofrenia, visando obter alternativas para o tratamento e conduta preventiva ao desenvolvimento da doença. (AU)

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O Diabetes mellitus é uma doença que afeta uma parcela significante da população mundial; apesar de grandes investimentos serem anualmente destinados às áreas de pesquisa e tratamento, estima-se ainda que o número de pessoas com diabetes chegue a 366 milhões até 2030. As estimativas indicam que o Brasil terá cerca de 11 milhões de diabéticos até 2030. O diabetes tipo 1 resulta de uma destruição autoimune das células beta pancreáticas que determina a condição clínica de hiperglicemia associada à hipoinsulinemia. Os estágios avançados da doença estão associados a complicações metabólicas que resultam em disfunção e perda da massa celular. No sistema nervoso, com o diabetes, há uma perda progressiva das funções cerebrais com alterações nos mecanismos celulares de aprendizado e memória. Estas alterações estão intimamente relacionadas com modificações no padrão bioelétrico das células do sistema nervoso com comprometimentos nos desvios do potencial de repouso destas células; a saber, potenciais de ação para os neurônios e potenciais eletrotônicos para as células da glia. O presente projeto de pesquisa propõe avaliar e integrar as alterações dos padrões metabólicos e de correntes de prótons determinadas pelo Diabetes mellitus do tipo 1 na microglia. (AU)

Resumo

A hiperplasia prostática benigna (HPB) é uma afecção de alta incidência, tanto na espécie canina como na humana. Todavia, algumas lacunas permanecem não elucidadas a cerca da doença, como por exemplo, a fisiologia hormonal envolvida na etiopatogenia da HPB, ou mesmo a análise criteriosa da hemodinâmica vascular envolvida, que pode fomentar novas ferramentas de diagnóstico precoce. Além disso, a terapia de escolha para tratamento da HPB, em homens e cães, ainda não está totalmente estabelecida perante seu possível efeito colateral, ocasionando certa controvérsia em seu uso em escala clínica reprodutiva. Em face do exposto, o objetivo dessa pesquisa é promover a caracterização das alterações decorrentes da hiperplasia prostática benigna em cães submetidos a diferentes tratamentos, utilizando de recursos como a ultrassonografia Doppler com o intuito de observar as mudanças hemodinâmicas envolvidas em próstata e testículos, a técnica de imunohistoquímica para avaliar a expressão do fator VEGF na próstata acometida e tratada, a histologia para observar possíveis alterações estruturais nos testículos, além de outras técnicas, que tem como objetivo avaliar a fisiopatologia da HPB, como avaliações em nível hormonal, dosando os principais hormônios envolvidos (testosterona, estrógeno e di-hidrotestosterona) e em nível seminal, avaliando o estresse oxidativo envolvido, as enzimas antioxidantes e os parâmetros de qualidade seminal. Desta forma, este trabalho espera contribuir para maiores elucidações quanto aos aspectos fisiológicos, ao diagnóstico clínico e o tratamento de escolha da hiperplasia prostática benigna em homens e cães. (AU)

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