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Resumo

A Esclerose Múltipla (EM) é uma doença autoimune crônica, manifestada morfologicamente por inflamação e desmielinização do sistema nervoso central (SNC). Esse processo inflamatório provoca lesão axonal e perda de mielina. Em modelos animais, é possível observar degeneração axonal, bem como inflamação, similares ao observado em humanos com EM. Além disso, recentemente demonstramos a ocorrência de intenso rearranjo dos circuitos medulares durante o curso da doença em ratos submetidos à encefalomielite experimental autoimune (EAE). Contudo, não são ainda bem compreendidos os efeitos de sucessivos surtos e remissões sobre a citoarquitetura dos circuitos medulares. Assim, no sentido de melhor entender esses fenômenos, utilizaremos camundongos submetidos à forma remitente/recorrente da EAE, sendo analisados os resultados em nível de imunohistoquímica e ultraestrutura. Os camundongos serão submetidos à EAE por meio de aplicações de 100µl no plexo braquial direito e esquerdo de cada animal, contendo o peptídeo de MOG35-55 diluído em PBS e Mycobacterium tuberculosis emulsificada com adjuvante completo de Freund. Os grupos serão dividivos em: 10 animais controle, 10 animais no surto (13º dia após EAE), 10 animais na 1º remissão (15º dia após EAE) e 10 aimais na 4º remissão (17º dia após EAE). Todos os animais serão sacrificados através de perfusão. Em cada grupo 5 animais serão processados para microscopia eletrônica de transmissão e 5 animais serão processados em imunohistoquímica. (AU)

Resumo

A criopreservação de oócitos, atualmente considerada como técnica experimental tem o potencial de se constituir em método de grande relevância no tratamento de pacientes com necessidade de preservação da fertilidade e de técnicas de reprodução assistida. A ocorrência de alterações citoarquiteturais e cromossômicas em oócitos congelados já foram relatadas em humanos e em outras espécies animais. Este estudo tem como objetivo, avaliar as alterações do fuso meiótico e a ocorrência de aneuploidias em oócitos humanos submetidos à criopreservação pela técnica de congelação lenta ou de vitrificação em estágio de vesícula gerrninativa. Com esse propósito, oócitos em estágio de vesícula germinativa, considerados imaturos, coletados de pacientes submetidas a fertilização in vitro no Centro de Reprodução Humana Mário Covas do HCFM-USP, serão divididos de forma randômica e congelados utilizando-se duas diferentes técnicas: congelação lenta e vitrificação. Esses oócitos, quando imaturos, são usualmente descartados, pois, não são aplicáveis para uso clínico. Análise do fuso meiótico será realizada por microscópio invertido equipado com uma câmera de vídeo analógica e um sistema de imagens que combina luz polarizada em cristal líquido denominado ICSI Guard Octax TM. Essa análise acontecerá após cultura dos oócitos e progressão para estágio de metáfase I e metálase II. Esse sistema microscópico possibilita a visualização de células vivas. Além disso, os oócitos descongelados serão submetidos à análise cromossômica por meio de cariótipo após serem cultivados até o estágio de metáfase II, quando são considerados oócitos maduros com possibilidades de uso em fertilização in vitro. (AU)

Resumo

O presente trabalho tem como objetivo estudar os efeitos da desnutrição e renutrição proteica no fígado, sob os aspectos morfométricos, estereológico e quantitativo. Assim sendo serão utilizados quinze camundongos Swiss machos com 60 dias de idade aos quais foram oferecidos água sem restrições (Ad libidum), uma dieta proteica (12% de proteína-caseina) ou uma dieta hipoproteica (2% de caseina), sendo um grupo de animais renutrido com dieta normoproteica. Aos 21 dias os animais serão ortoeutanasiados e será retirado o fígado. Para o estudo histológico qualitativo e quantitativo, o material será fixado com solução de Karnovsky modificado (Glutaraldeído 5% e formoldeído 1%) em tampão de cacodilato de sódio (0,125 M e pH 7.4). Em seguida, o material será desidratado em séries de alcoóis e posteriormente embebido em araldite. Cortes sistemáticos serão realizados e métodos estereológicos serão empregados para estimar o volume do fígado com respectivo "intervalo de confiança", número total de hepatócitos, bem como seu volume. Desta forma, espera-se que os dados gerados por este estudo possam avaliar (com acurácia tridimensional) os efeitos da desnutrição e renutrição na celularidade hepática. Palavras-chave: Estereologia, Desnutrição, Fígado. (AU)

Resumo

O treinamento de um técnico de nível superior é importante para a continuidade do projeto de pesquisa. Há uma grande quantidade de material disponível para o projeto e várias metodologias de rotina são empregadas no seu processamento técnico. Nosso projeto temático tem obtido resultados interessantes que foram recentemente apresentados em congressos e publicados em periódicos internacionais (Bando et al 2011, Allegro et al 2012). O treinamento de um técnico de nível superior é necessário para suprir o processamento de rotina das amostras e também permitirá aumentar a eficiência da coleta de dados histopatológicos referentes ao projeto. O treinamento deve incluir processamento do tecido cerebral e capacitacao para coleta e analise de dados basicos de histopatologia e imunohiostoquimica. Em resumo, os hipocampos serão fixados por imersão, crioprotegidos, congelados e cortados em criostato para obtenção de fatias com 60 µm de espessura. Uma em cada cinco fatias histológicas será montada em lâmina gelatinizada para coloração de Nissl (Violeta de Cresila) e as demais armazenadas em solução crioprotetora para posterior estudo imunohistoquímico. Três fatias representativas das porções inicial, média e final de cada hipocampo serão coradas por hematoxilina-eosina (HE) e encaminhadas para exame e registro anatomopatológico. O hipocampo inteiro de cada caso será utilizado (média de 50-60 fatias/paciente). Serão excluídos casos com artefatos de processamento que prejudiquem e/ou inviabilizem as análises subsequentes. A análise morfométrica compreende as medidas lineares obtidas na camada granular do giro denteado, focalizando áreas de dispersão. A análise será feita nas imagens de quatro fatias do corpo de cada hipocampo processado para coloração de Nissl, adquiridas com um estereomicroscópio e utilizando-se o programa Image J (Image J, NIH, Bethesda, Maryland, USA). A avaliação semiquantitativa dos hipocampos escleróticos será feita em quatro fatias do corpo do hipocampo. Serão focalizadas as alterações do giro denteado, particularmente a desorganização da citoarquitetura: perda e dispersão celular e bilaminação da camada granular. A perda celular será determinada como áreas de falha na continuidade ou diminuição da espessura da camada granular do giro denteado, sendo graduada de zero (sem perda) a quatro (perda total). A dispersão das células granulares será definida como áreas de "espalhamento" das células granulares além dos limites normais do giro denteado, sendo graduada de zero (sem alteração) a três (alteração muito intensa). A bilaminação será definida como duplicação bem definida do todo ou parte da camada granular e será descrita como presente (+) ou ausente (-). (AU)

Resumo

A desnutrição protéico-calórica é um problema de dimensões alarmantes, correspondendo a cerca de 40% das causas de hospitalização. Em virtude de sua complexidade metabólica e altas taxas de renovação e reposição celular o fígado é um dos orgãos mais afetados pela desnutrição. Portanto objetiva-se analisar, utilizando microscopia quantitativa tridimensional (Bioimagem e Estereologia), os efeitos da dieta hipoprotéica (e da reversão da mesma) na macro e microestrutura do fígado. Para tal utilizaremos vinte camundongos Swiss machos com idade inicial de 60 dias de idade (peso corpóreo médio inicial = 55 gramas ± 2DP) e provenientes de colônias mantidas pelo Biotério da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo (USP). Os animais serão subdivididos em quatro grupos dependendo do tipo de dieta oferecido: Grupo I - animais nutridos (n=5); Grupo II - animais desnutridos (n=5); Grupo III - animais renutridos (n=5); Grupo IV - animais controle para os renutridos (n=5). Os animais do grupo I e IV receberão uma dieta normoprotéica (12% de caseina) e os animais dos grupo II e III receberão uma dieta hipoprotéica (2% de caseina). A renutrição será conduzida nos animais do grupo III, continuando-se a manter em paralelo animais do grupo IV. Após um mês recebendo ração hipoprotéica, os animais do grupo III receberão ração normoprotéica e água ad libitum. O processo de renutrição ocorrerá por mais 30 dias. Todos os animais serão eutanasiados e utilizados para a obtenção, além do fígado, do sangue, medula óssea e baço para as análises ulteriores. Do ponto de vista estereológico serão estimados o volume do fígado, o número total e o volume médio dos hepatócitos, o volume total de vasos no fígado e o volume total do tecido colágeno na matriz extracelular do fígado. Entende-se que os conhecimentos gerados por esta pesquisa serão fundamentais para o diagnóstico e tratamento das hepatopatias de origem nutricional. (AU)

Resumo

O núcleo supraquiasmático (NSQ), principal relógio biológico circadiano em mamíferos, contém uma variedade de diferentes neurônios os quais tendem a formar grupos organizados em seu interior (Moore et al., 2002). As descrições dos padrões de distribuição destes tipos celulares, assim como, das principais terminações aferentes a este núcleo e suas relações levaram alguns autores a dividi-lo anatomo-funcionalmente em: porção ventrolateral e porção dorsomedial ou ainda cerne (do inglês core) e concha (do inglês shell) (Moore et al., 2002). Embora tal nomenclatura tenha sido extrapolada para várias espécies, esta organização intrínseca tende a apresentar diferenças nas espécies já estudadas e pouco se sabe sobre a citoarquitetura deste núcleo em primatas (Morin e Allen, 2005; Morin et al., 2006; Pinato et al.,2007). O presente estudo, complemento de projeto do laboratório em curso com pós-doc e doutoranda, propõe a caracterização química do NSQ do primata diurno Cebus apella utilizando métodos com reações de imunoistoquímica e imunofluorescência para avaliar o padrão de distribuição dos principais grupos neuronais e projeções aferentes a este núcleo, assim como suas relações. Os resultados preliminares mostram que, nesta espécie, o NSQ apresenta organização complexa caracterizada por grupos celulares peptidérgicos (vasopressina (VP), calbidina (Calb) e calretinina (Cair)) e terminações aferentes (neuropepideo Y (NPY), serotonina (5-HT) e terminais retinianos (CTb-ir)) que na maioria dos casos apresentam diferenças de localização em comparação a roedores. Os dados preliminares suportam a hipótese de que há importantes diferenças interespecíficas na estrutura e características intrínsecas do NSQ e que, em primatas a organização deste núcleo deve ser mais complexa do que a organização classicamente dividida em "core" e "shell", ou seja cerne e concha, (Morin et al., 2006). (AU)

Resumo

O receptor de membrana CD36 é uma glicoproteína encontrada em vários tiposcelulares de mamíferos exercendo funções de facilitação do transporte internalizadorde ácidos graxos, regulação da angiogênese, modulação da atividade plaquetária,reconhecimento específico de lipoproteínas oxidadas e de certos produtos debactérias e fungos. Este receptor pode também estar envolvido em respostas aestímulos sensoriais, pois o CD36 de roedores e o homólogo de Drosophilamelanogaster estão envolvidos na preferência por dietas gordurosas e na sinalizaçãode feromônio lipídico, respectivamente. A presença do trancrito do Cd36 emneurônios no epitélio olfatório (OE) e no sistema nervoso central (SNC) foiverificada recentemente, mas a função da proteína nestes locais ainda édesconhecida. A proposta em questão tem por finalidade co-localizar o receptor commarcadores de tipos neuronais específicos do OE e das regiões relevantes do SNC. Ouso de camundongos que não expressam CD36 (Cd36 Obl) será empregado paravalidação de imunomarcação e avaliação da citoarquitetura na ausência do receptor.Os objetivos propostos, juntamente com a determinação da localização celular damolécula nestes neurônios, permitirão estabelecer protocolos experimentaisadequados para revelar a função neuronal do CD36. (AU)

Resumo

O retículo endoplasmático é uma organela multifuncional envolvida na síntese, processamento e modelamento de proteínas, bem como participa do transporte intracelular e sinalização por cálcio. A VAPB é uma proteína transmembrana do retículo endoplasmático, interage com a mitocôndria para a homeostase do cálcio, participa da sinalização celular, da citoarquitetura, do processo de resposta a proteínas maldobradas e do tráfego entre o retículo endoplasmático e o complexo de Golgi. Este tráfego também é realizado pela proteína Rab1. O estresse do retículo endoplasmático pode estar associado à disfunção destas proteínas bem como é um evento comum às doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica. Desta forma, o presente estudo visa analisar a relação entre a expressão da VAPB, Rab1 e o estresse do retículo endoplasmático em neurônios motores de camundongos neonatos transgênicos para a SOD1 humana mutante (G93A), SOD1 não mutante e controles (B6SJL). A metodologia a ser empregada envolve genotipagem, cultura de neurônios motores, imunocitoquímica, western blot e expressão exógena da Rab1. (AU)

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