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A função do gene AIRE e de micro RNAs no controle da adesão de células tímicas epiteliais medulares com timócitos

Processo: 13/17481-1
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Regular
Vigência: 01 de abril de 2014 - 31 de março de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
Pesquisador responsável:Geraldo Aleixo da Silva Passos Júnior
Beneficiário:Geraldo Aleixo da Silva Passos Júnior
Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto, SP, Brasil
Pesq. associados:Silvana Giuliatti
Assunto(s):Genética molecular  Expressão gênica  Timo  MicroRNAs  Transcriptoma  Timócitos 

Resumo

O timo desempenha seu papel na indução da tolerância imunológica central aos antígenos relacionados aos tecidos próprios (TRAs) sendo que na medula desse órgão, nas células tímicas medulares epiteliais (mTECs) ocorre a expressão de centenas desses TRAs que, por sua vez, representam virtualmente todos os órgãos e tecidos do corpo. Devido à diversidade de representação, este fenômeno foi chamado de expressão gênica promíscua (PGE) a qual é em grande parte controlada pelo gene Autoimmune regulator (Aire). A seleção negativa de timócitos auto reativos é essencial para que ocorra a tolerância imunológica. Os timócitos oriundos da medula óssea migram para o timo e na medula desse órgão, interagem com as células mTEC que expressam os TRAs (adesão mTECs-timócitos). Os clones de timócitos que reconhecem com avidez os TRAs apresentados pelas mTECs via MHC-II são então eliminados por apoptose (seleção negativa). Como o gene Aire controla parte da PGE/TRAs, presume-se que a ação deste gene deve influenciar a adesão mTECs-timócitos e indiretamente a apoptose dos timócitos (seleção negativa). Como este ponto é ainda elusivo, formulamos as seguintes hipóteses deste projeto: 1) A expressão do gene Aire influencia a adesão mTECs-timócitos e consequentemente a apoptose de timócitos, 2) Os microRNAs (miRNAs) controlam o processo de adesão mTECs-timócitos, 3) Os miRNAs controlam a expressão de TRAs, 4) Os miRNAs controlam a expressão do gene Aire. Nosso objetivo geral é estudar o controle transcricional de TRAs exercido por Aire em mTECs e também o controle pós-transcricional exercido por miRNAs e sua consequência na adesão mTECs-timócitos. Recentemente demonstramos que a linhagem de células murinas (M. musculus) mTEC 3.10 (MHCII+, CD80+) expressa em cultura o gene Aire e que esse gene controla, além de um grande conjunto de TRAs, muitos miRNAs. Além disso, essa linhagem é capaz de reproduzir in vitro a adesão mTECs-timócitos. Isso consolida o principal sistema modelo para testarmos essas hipóteses que é o ensaio de adesão mTECs-timócitos. Utilizaremos a técnica de silenciamento in vitro de Aire e da ribonuclease Dicer por meio de siRNA (anulação transitória) e também a seleção de células knockout (KO) por meio da transfecção com um vetor CompoZr-KO-Aire ou -Dicer (anulação permanente). Utilizando as células mTEC 3.10 manipuladas (siRNA/KO Aire e/ou Dicer) testaremos a participação de Aire e/ou de miRNAs no modelo de adesão in vitro. O transcriptoma (mRNAs) e o miRnoma (miRNAs) dessas células serão avaliados por meio de microarrays na tentativa de identificarmos genes de TRAs e/ou de moléculas de adesão celular envolvidos. O sequenciamento (next-generation sequencing) será utilizado para avaliar a expressão de isoformas de Aire e também das regiões 3´UTR de TRAs que poderiam anelar (ou não) com miRNAs. Finalmente, para confirmarmos a atuação de miRNAs sobre Aire, faremos uso do sistema modelo luciferase reporter assay com o qual testaremos a hibridização de miRNAs (preditos) na sequencia 3´UTR desse gene. Dessa forma, contribuiremos com melhor entendimento do controle transcricional e pós-transcricional que ocorre durante a adesão mTECs-timócitos, processo essencial para que ocorra a seleção negativa e indução da tolerância central. (AU)

Matéria(s) publicada(s) na Agência FAPESP sobre o auxílio:
Estudo avança compreensão de como surgem as doenças autoimunes  

Publicações científicas (6)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
SPECK-HERNANDEZ, CESAR A.; ASSIS, AMANDA F.; FELICIO, RAFAELA F.; COTRIM-SOUSA, LARISSA; PEZZI, NICOLE; LOPES, GABRIEL S.; BOMBONATO-PRADO, KARINA F.; GIULIATTI, SILVANA; PASSOS, GERALDO A. Aire Disruption Influences the Medullary Thymic Epithelial Cell Transcriptome and Interaction With Thymocytes. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, v. 9, MAY 7 2018. Citações Web of Science: 0.
PASSOS, GERALDO A.; SPECK-HERNANDEZ, CESAR A.; ASSIS, AMANDA F.; MENDES-DA-CRUZ, DANIELLA A. Update on Aire and thymic negative selection. IMMUNOLOGY, v. 153, n. 1, p. 10-20, JAN 2018. Citações Web of Science: 0.
OLIVEIRA, ERNNA H.; MACEDO, CLAUDIA; COLLARES, CRISTHIANNA V.; FREITAS, ANA CAROLINA; DONATE, PAULA BARBIM; SAKAMOTO-HOJO, ELZA T.; DONADI, EDUARDO A.; PASSOS, GERALDO A. Aire Downregulation Is Associated with Changes in the Posttranscriptional Control of Peripheral Tissue Antigens in Medullary Thymic Epithelial Cells. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, v. 7, NOV 23 2016. Citações Web of Science: 3.
PEZZI, NICOLE; ASSIS, AMANDA FREIRE; COTRIM-SOUSA, LARISSA COTRIM; LOPES, GABRIEL SARTI; MOSELLA, MARITZA SALAS; LIMA, DJALMA SOUSA; BOMBONATO-PRADO, KARINA F.; PASSOS, GERALDO ALEIXO. Aire knockdown in medullary thymic epithelial cells affects Aire protein, deregulates cell adhesion genes and decreases thymocyte interaction. Molecular Immunology, v. 77, p. 157-173, SEP 2016. Citações Web of Science: 4.
PASSOS, GERALDO ALEIXO; MENDES-DA-CRUZ, DANIELLE AREAS; OLIVEIRA, ERNNA HERIDA. The thymic orchestration involving Aire, miRNAs, and cell-cell interactions during the induction of central tolerance. FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, v. 6, JUL 14 2015. Citações Web of Science: 10.
MACEDO, CLAUDIA; OLIVEIRA, ERNNA H.; ALMEIDA, RENATA S.; DONATE, PAULA B.; FORNARI, THAIS A.; PEZZI, NICOLE; SAKAMOTO-HOJO, ELZA T.; DONADI, EDUARDO A.; PASSOS, GERALDO A. Aire-dependent peripheral tissue antigen mRNAs in mTEC cells feature networking refractoriness to microRNA interaction. Immunobiology, v. 220, n. 1, p. 93-102, JAN 2015. Citações Web of Science: 6.

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