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Publicado em: Clínica Veterinária em 1 de Julho de 2008

Eletroquimioterapia: uma nova promessa para o tratamento de cânceres em animais

Resumo: A eletroquimioterapia é uma nova modalidade de terapia de controle local para neoplasias sólidas. A administração do agente antineoplásico posteriormente à realização da eletroporação no tumor são os princípios da técnica. Suas principais características são os poucos efeitos colaterais, não promover mutilações na maioria dos casos em que se aplica além de não mostrar diminuição em sua eficiência frente a reaplicações em possíveis recidivas A terapia vem apresentando resultados bastante satisfatórios tanto para carcinomas quanto para sarcomas na medicina humana e na medicina veterinária os estudos estão avançando, conferindo a esta uma grande expectativa de vir a ser outra opção de tratamento. No Brasil, o Laboratório de Oncologia Experimental da FMVZ/USP vem desenvolvendo pesquisas e obtendo resultados expressivos com a técnica e espera em breve publicá-los, possibilitando a aplicação da técnica na rotina das clínicas.

Unitermos: eletroporação, quimioterapia, bleomicina, cisplatina

Introdução

Os tratamentos de câncer atualmente disponíveis podem ser divididos em diferentes categorias, de acordo com seus objetivos e modos de ação. Freqüentemente são utilizados como tratamento único ou combinados. As três principais categorias de tratamentos são a cirurgia, a radioterapia, que são tratamentos localizados, e a quimioterapia, uma modalidade sistêmica. Dentre essas opções de tratamento, os efeitos colaterais tardios e graduais, o potencial oncogênico e o custo alto são os principais inconvenientes da radioterapia, e os necessários procedimentos mutuantes e desfigurantes constituem-se nas principais limitações da cirurgia . Já o tratamento com fármacos antineoplásicos apresenta principalmente limitações de toxicidade, relacionadas a sua inespecificidade por células tumorais e às altas doses requeridas, o que tem incentivado o desenvolvimento de novos mecanismos para facilitar a entrada do fármaco na célula.

Eletroporação

Embora pouco percebido na época, o fenômeno de “quebras elétricas” reversíveis na membrana celular, mais tarde definido como eletroporação ou eletro permeabilização, foi relatado em 1958. Quase uma década depois, foi realiza da a destruição não térmica de microorganisinos submetidos a altos pulsos elétricos. Em 1972, constatou-se grande aumento da permeabilidade das vesículas submetidas a pulsos elétricos. Em 1982 foi feita a transferência de genes utilizando pulsos elétricos, e finalmente, em 1988, foi observado o aumento da citotoxicidade da bleomicina in vitro e in vivo com o uso de pulsos elétricos, o que viria a ser posteriormente denominado eletroquimioterapia . A eletroporação, processo conhecido há aproximadamente vinte anos, tem como objetivo facilitar a entrada na célula, de moléculas normalmente não permeáveis à membrana Atualmente esse processo tem sido amplamente utilizado em biologia molecular, biotecnologia e medicina para o transporte de genes e fármacos para dentro das células. Dentre as aplicações mais promissoras da eletroporação destacam-se a transferência de DNA, pois o método é eficiente, seguro e não viral para a terapia gênica, e a eletroquimioterapia para o tratando do câncer. Recentemente, a eletroporação foi associada com sucesso à terapia fotodinâmica in vitro, com o objetivo de aumentar os níveis de fotosensibilizadores nas células tumorais.

Fundamentos da eletroporação

Quando uma célula é submetida a um campo elétrico, uma diferença de potencial transmembrana é induzida em sua membrana. Se essa voltagem transmembrana induzida atingir determinados valores, começa-se a observar aumento de permeabilidade. Esse fenômeno é denominado eletroporação ou eletropermeabilização . Os poros são inicialmente gerados onde o campo elétrico induzido superar a diferença de potencial transmembrana, descrita como sendo aproximadamente 200mV para células eucarióticas. A intensidade do campo induzido determinará a área de eletroporação, e o tempo de duração e o número de pulsos definirão o tamanho do poro ‘. A eletroporação está fortemente relaciona da com o padrão de amplitude, a duração, a freqüência, o número e a formado pulso elétrico aplicado. Os poros formados pelo campo elétrico aplicado poderão ser reversíveis, mantendo a viabilidade da célula após a aplicação. Se os valores de amplitude e duração excederem determinados padrões de pulso elétrico suportáveis pela membrana os poros se tomam irreversíveis, desencadeando a morte da célula “. Os poros formados pela eletroporação permitem que moléculas de peso molecular com valores acima de 30.000 Da, normalmente não permeáveis, penetrem na célula . Enquanto a formação dos poros se dá quase que imediatamente à aplicação do campo elétrico, seu fechamento pode demorar de alguns segundos a minutos. A exposição de tecidos ao campo elétrico na eletroporação também promove outros fenômenos, como uma transiente diminuição do fluxo sangüíneo, possibilitando um maior tempo para penetração do fármaco pelos poros formados. Isso proporciona maior concentração intra celular do fármaco circulante no tecido exposto O efeito citotóxico da eletro-quimioterapia também atinge o estroma do tumor, causando um efeito de ruptura vascular. Ainda, há promoção de um intenso derramamento de antígenos tumorais no organismo, o que faz com que a resposta ao tratamento seja diferente em pacientes imunocompetentes e imunodeficientes.

Eletroquimioterapia

À combinação de quimioterapia sucedida de eletroporação denominou-se eletroquimioterapia, uma nova modalidade de terapia antineoplásica. O processo consiste em potencializar a ação de um fármaco, antes com baixa ou nenhuma permeabilidade na membrana da célula, através do fenômeno de eletroporação. A bleomicina, um fármaco de alto poder citotóxico intrínseco porém impermeável à membrana, teve, in vitro, seu efeito aumentado cerca de 8.000 vezes com a eletroporação. Esse fármaco, sem eletroporação, é intemalizada na célula por endocitose mediada por proteína carreadora. Dessa forma, seu transporte para dentro da célula depende da quantidade de exposição de tais proteínas na membrana celular, e da velocidade com que elas são endocitadas. Outro fármaco também utilizado em eletroquimioterapia é a cisplatina, que é pouco permeável à membrana e, in vitro, teve seu efeito potencializado cerca de 80 vezes com a eletroporação. A eletroquimioterapia é uma técnica de tratamento localizado de diversos tipos de tumores sólidos, sejam eles cutâneos ou subcutâneos. Pelas bases físico-químicas descritas anteriormente pode-se notar que, teoricamente, o tratamento é eficiente em todos os tumores em que se consiga realizar o procedimento.

Procedimento eletroquimioterápico

O procedimento eletroquimioterápico consiste basicamente na administração do fármaco no indivíduo ou meio de cultura para estudos in vitro, e posterior exposição do tecido ou células aos pulsos elétricos por meio de eletrodos. Já foi descrita a realização de eletroquimioterapia transoperatória ou pós-operatória nas adjacências da margem cirúrgica da neoplasia, com resultados satisfatórios. Nesses casos, foi administra da juntamente a hialuronidase, na dose aproximada de 300 UI, para garantir distribuição mais uniforme do agente antineoplásico. O procedimento já foi realizado sem anestesia sendo bem suportado por animais, tanto com administração intratumoral quanto pela via intravenosa do fármaco antineoplásico Alguns procedimentos já foram realiza dos em camundongos após a administração de pentobarbital na dose de 45mg/kg, em gatos submetidos à administração anterior de metomidina e quetamina nas doses de 80µ/kg e 5mg/kg, respectivamente, e em cães que haviam recebido metomidina na dose de 100µ/kg. Em cavalos, o procedimento foi implementado sob anestesia geral de curta duração. Em humanos deve- se considerar a realização de anestesia geral para tumores maiores ou doloridos, e também quando da existência de grande número de tumores. Afora esses casos, pode-se utilizar anestesia local. Os fármacos utilizados são a bleomicina ou a cisplatina, e as vias de administração podem ser a intratumoral para ambas, ou a intravenosa para a bleomicina, com a mesma eficiência terapêutica para tumores de até 0,5cm A via intra venosa tem se mostrado mais eficiente em tumores com volumes maiores Q intervalo entre a administração do fármaco e a aplicação do campo elétrico deve ser suficiente apenas para que a concentração do fármaco na neoplasia alcance seu valor máximo. Em animais de laboratório esse intervalo varia de poucos minutos para a via intravenosa a imediatamente para a via intratumoral. Em humanos, o intervalo entre a administração do fármaco e a aplicação dos pulsos elétricos não deve ultrapassar dez minutos em caso de via intratumoral, já pela via intravenosa, a aplicação dos pulsos pode iniciar oito minutos após a administração do fármaco, sem ultrapassar 28 minutos. As doses recomendadas de bleomicina intravenosa e intratumoral são, respectivamente, 15 mg/m (0,5rng/kg) e 1 000UI/cm do volume de tumor e, para a cispiatina intratumoral, variam de 0,5 a 2mg/cm do volume de tumor As concentrações para a administração intratumoral podem ser de 1 000UI/ml e 2mg/mL para a bleomicina e a cisplatina, respectivamente . Com relação aos valores dos parâmetros dos pulsos elétricos aplicados, o protocolo mais utilizado e que tem se mostrado mais eficiente adota 8 pulsos de 100µs de duração, 1300 Vcm de amplitude, e frequência de 1Hz ou 5kHz. As principais diferenças entre as freqüências de pulso utilizadas estão relaciona das às contrações musculares desencadeadas pelos pulsos elétricos e ao tempo de tratamento. Com freqüências de 1Hz os pacientes sentem oito contrações, que podem também ocasionar desloca mento dos eletrodos e falhas no processo, e o tempo de aplicação dos pulsos dura aproximadamente 10 segundos. Quando se utilizam 5kHz, o processo de aplicação dura aproximadamente 1,5 milisegundos e o paciente sente apenas uma contração, diminuindo o desconforto e outras possíveis falhas decorrentes do deslocamento dos eletrodos. Para promover um bom contato entre os eletrodos e a pele, pode ser utilizado o gel condutor empregado em exames de ultra-som .

Eletrodos

A geometria dos eletrodos deve proporcionar a aplicação homogênea e constante dos pulsos elétricos no tecido neoplásico. Uma limitação importante do desenvolvimento em algumas neoplasias é justamente a inviabilidade de aplicação dos pulsos em determinadas regiões, como a intracraniana e a medula espinhal. Entre os diferentes eletrodos utilizados para a eletroquimioterapia, podem ser citados tanto aqueles em forma de placas quanto aqueles que têm agulhas eqüidistantes. Os principais materiais utilizados para a construção dos eletrodos são o alumínio e o aço, que é mais utilizado por ser mais acessível e manter mais estável a tensão entre o tumor e o eletrodo.

Efeitos colaterais

Os efeitos colaterais mais comuns da eletroquimioterapia são as contrações musculares involuntárias no local de aplicação dos pulsos elétricos, que cessam imediatamente ao final destes.

Em avaliação empreendida com 61 pacientes humanos, utilizando escala de dor que variava de zero (ausência de dor) a 100 (pior dor imaginável), a média ficou em 35 imediatamente após o tratamento, e caiu para 20 dois dias após o tratamento, naqueles que haviam recebido anestesia local. Já nos pacientes tratados sob anestesia geral, que foram avaliados somente dois dias depois da eletroquimioterapia, a média de dor foi 10. Outro resultado que indica que a eletroquimioterapia não é um tratamento estressante ou doloroso é o índice de aceitação de 93% dos pacientes para uma possível nova sessão. Em cães e gatos, não foram observadas queimaduras ou sangramentos no local da inserção dos eletrodos com agulhas. Mesmo depois de várias sessões, nenhum sinal de comprometimento do estado geral de saúde — decorrente da eletroquimioterapia costuma ser observado.

Após as sessões, a maioria dos animais apresenta comportamento normal e ausência de sinais de dor. Reação inflamatória local — com discreto eritema no tecido normal adjacente —, e formação de crosta superficial podem ser observadas nos primeiros dias após a aplicação. Em tumores maiores, algumas vezes verificam-se ulcerações do nódulo neoplásico. Ambas as lesões desaparecem em no máximo cinco semanas após o tratamento. Alterações bioquímicas e hematológicas são raras em pacientes submetidos à eletroquimioterapia.

Eficiência terapêutica

Diversas triagens clínicas foram realizadas em humanos para avaliar a eficiência terapêutica da eletroquimioterapia. Os índices de resposta completa (RC), resposta parcial (RP), resposta objetiva (RO = RC+RP), estabilização da doença (ED) e progressão da doença (PD) foram divididos para melanomas e não melanomas, e também em relação ao uso da bleomicina ou da cisplatina, como demonstram as figuras 2 e 3. Foram adotados os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS) para avaliar os resultados de tratamentos de câncer, segundo os quais RC indica que o tumor passa a não ser mais palpável, RP representa diminuição maior que 50% no volume do tumor, ED corresponde a diminuição menor que 50% e aumento de até 25%, e PD significa aumentos superiores a 25%. Um mínimo de quatro semanas foi necessário para qualificar as respostas ao tratamento. Os resultados foram bastante promissores, alcançando índices de RO predominantemente maiores que 80%, conforme mostrado nas figuras 2 e 3. Em casos de recidiva ou de tumores maiores, para os quais uma única sessão não seja suficiente, a eletroquimioterapia pode ser realizada novamente, com a mesma eficiência, em intervalos de três a seis semanas. Tumores já tratados com cirurgia, quimioterapia ou radioterapia que apresentarem comportamento refratário ou recidiva também podem ser tratados com eletroquimioterapia sem interferência em sua eficiência Alguns experimentos têm demonstrado que a eletro-quimioterapia pode se constituir em uma opção de tratamento conservativo para sarcomas localizados nas extremidades de membros. Em pesquisas realizadas em animais, o índice de RO é de aproximadamente 80%, sendo em muitos casos observada, já após a primeira sessão, parcial ou completa remissão do tumor. As figuras 4, 5, 6 e 7 mostram a evolução de um carcinoma de células escamosas em membro torácico de um mastiff Inglês tratado com eletroquimioterapia. As figuras 8, 9, 10, 11 e 12 mostram a evolução de um caso de sacoma sinovial em membro torácico em cão. As figuras 13, 14 e 15 mostram a evolução de um carcinoma de células escamosas em plano nasal de gato trata do com eletroquimioetrapia. Em todos esses casos, pôde-se observar total remissão do tumor.

Pode-se observar, na figura 2, que a via de administração dos fármacos pode ser tanto intratumoral quanto intra venosa, porém, para maior eficiência com a cisplatina, deve-se utilizar a via intratumoral.

Considerações finais

Atualmente, a medicina veterinária no Brasil apresenta poucas opções viáveis para o tratamento de câncer em animais. As terapias disponíveis restringem-se quase que exclusivamente à cirurgia e à quimioterapia.

Outras opções, como a criocirurgia e terapia fotodinâmica também estão disponíveis, mas suas aplicações são restritas a apenas alguns cânceres, ficando diversos casos sem opção de tratamento que apresente resultados satisfatórios. A radioterapia, que já é utilizada em outros países, tem alto custo de infra-estrutura e manutenção, além de não estar regulamentada para aplicação em medicina veterinária; assim, sua utilização está restrita a poucos centros de pesquisa nacionais. A eletroquimioterapia, como apresentado neste trabalho, pode vir a ser uma opção viável na medicina veterinária do país. Os resultados promissores alcançados na Europa, tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária, qualificam-na como urna nova modalidade a ser implantada nos próximos anos.

Agradecimentos

Marcelo Monte Mor Rangel é bolsista da FAPESP em nível de mestrado (processo n. 07-51972-1). O projeto, ainda em nível experimental, foi contemplado com auxílio à pesquisa da FAPESP (processo n. 07-59391-8).

Revista Clínica Veterinária – Oncologia – 01/07/2008 – Págs. 30 a 36